Espetrofotometria


Universidad de Buenos Aires
Facultad de Farmacia y Bioquímica

Informe N°10

ESPECTROFOTOMETRÍA

Fecha de entrega: 18/06/15

OBJETIVOS:
Realizar los siguientes controles a los espectrofotómetros: luz espuria, volumen mínimo, cubetas, centro de Banda, linealidad fotométrica, veracidad, precisión.
Calcular la concentración de proteínas de una solución empleando la reacción del Biuret comotécnica espectrofotométrica.

FUNDAMENTOS:
La espectrofotometría se refiere a una serie de técnicas que permiten obtener información al analizar interacciones de las radiaciones electromagnéticas con la materia. Se utiliza para obtener la concentración de una solución de manera precisa, midiendo el efecto que dicha concentración tiene sobre la intensidad de un haz de luz que incide sobre ella.
Paracomprender que sucede en el seno de la solución con el analito cuando la atraviesa un haz de luz, se coloca la misma en una cubeta de material transparente y no absorbente. Al iluminar la cubeta de la solución luz monocromática, parte de la intensidad de esa luz (Io) va a ser absorbida por las moléculas que están en dicha solución (Ia), parte se refleja (Ir) y parte será transmitida (It).

La sumade estas tres últimas energías tiene que ser igual a Io para mantener el principio de conservación de la energía:
Io= Ia + Ir + It

Con esta ecuación podemos llegar a la expresión de la ley de Grotthus-Draper:
1= S + T
S: absorción
T: transmitancia

La ley de Lambert-Beer nos dice que la intensidad de luz monocromática transmitida por la solución de cierta sustancia decrece geométricamente cuandosu concentración aumenta aritméticamente. La transmitancia decae en forma exponencial con la concentración (no guardan relación lineal).
T=10 –a.c.l
a: absortividad
c: concentración
l: espesor del material interpuesto

La absortividad (a) es una constante propia de cada sustancia, que depende de la longitud de onda, la temperatura y el solvente. Se puede definir como la absorbancia (Abs) de unasolución de concentración unitaria de una sustancia, bajo un espesor unitario.
A= Abs/(l.c)
Cabe destacar que la variable real es la transmitancia y no la absorbancia, ésta es obtenida a partir de tratamientos matemáticos para simplificar el cálculo, ya que presenta una relación directamente proporcional con la concentración de la sustancia.
Al medir los valores de Absorbancias de una misma solucióncoloreada a diferentes longitudes de onda (barrido espectral) y graficar los valores de Absorbancia en función de longitud de onda, podemos obtener el espectro de absorción de la sustancia. Esto es característico de cada sustancia.

INSTRUMENTACIÓN
Esquema de un espectrofotómetro:
Para asegurar el buen funcionamiento del equipo, es necesario realizar los siguientes controlesespectrofotométricos:

1) Control de la luz espuria accidental
Debemos evitar que llegue al detector cualquier tipo de luz que no atraviese la muestra cuya absorbancia se quiere medir. Puede provenir de diferentes lados (reflexiones internas dentro del tubo, luz que pasa por encima del menisco de la solución, luz que llega por los costados de la muestra). Es importante detectarla y reducirla para evitar desviacionesde la linealidad instrumental, dado que llega al detector más luz de la que debería. Se mide en % de transmitancia y el máximo aceptado es del 1%.
La luz espuria parásita es la radiación electromagnética de longitud de onda distinta a la seleccionada con el selector de aparato que puede o no pasar por la muestra. Esto provoca un aumento no deseado de la transmitancia ya que la luz espuria parásitano es absorbida por la solución en la misma proporción que la nominal. Este fenómeno es más común en los extremos del espectro visible. Para detectarla se suele utilizar paranitrofenol ya que tiene su pico de absorción en uno de los extremos del visible.

2) Control de volumen mínimo
Se considera así al mínimo volumen contenido en una cubeta a partir del cual la lectura se estabiliza y no...