Extracción de adn

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Grupo de Biología
http://dfmf.uned.es/biologia




CUADERNO DE PRÁCTICAS
PRESENCIALES
CURSO 2011-2012




Biología (1er parcial)
Licenciatura Ciencias Ambientales


Biología I
Grado Ciencias Ambientales
















DATOS DEL ALUMNO




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EXTRACCIÓN DE ADN


A.-Describa los fundamentos del protocolo de extracción de ADN, indicando la función de cada uno de los componentes del tampón de lisis, así como el objetivo de cada uno de los pasos llevados a cabo.


B.- El ADN obtenido se puede emplear en diversas técnicas de laboratorio, entre ellas la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el Southern Blot. Explique en qué consisten estas técnicas y cuál essu utilidad.





A.-El método que se va a emplear es el utilizado para extraer ADN genómico y consta de varios pasos, el primero de los cuales es la homogeneización del material empleado de manera mecánica en presencia de detergentes. Mediannte esta combinación de acción mecánica y detergentes se rompen las distintas membranas de la célula (citoplásmica y nuclear) y se libera el ADN almedio de lisis. Los detergentes, además, tienen una actividad inhibitoria sobre algunas proteínas de tal manera que impiden la acción de las enzimas que degradan el ADN liberadas al romperse los lisosomas de la cécula. A continuación, se eliminan los grandes gragmentos de restos de tejido y células por medio de una filtración, recuperándose el ADN y las proteínas en la solución acuosa.Finalmente se recupera el ADN por medio de una precipitación alcohólica con etanol o isopropanol.





PARTE EXPERIMENTAL





Tomamos 25 g de guisantes congelados y añadimos 50ml de la disolución de lisis.





I.-La disolución de lisis tiene 3 componentes:





A: Un detergente (generalmente SDS) , cuya función es romper las bicapas lipídicas de las membranas y unirse alas cargas positivas de las proteínas cromosómicas liberan el ADN a la disolución acuosa.


B: Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), se encarga de secuestrar los cationes Mg2+ que las enzimas que degradan el ADN necesitan para llevar a cabo su actividad.


C: Cloruro sódico, mantiene la doble hélice del ADN y actúa sobre las histonas liberándolas del ADN. Se incuba la disolución.La homogeneización la realizamos utilizando una batidora. Incubamos la disolución durante 15 minutos a 55ºC para acabar de lisar las células y liberar el ADN.





II.-Filtración del homogeneizado: Se filtra en un embudo utilizando una gasa. Las piezas grandes no lisadas quedan en el filtro mientras que la disolución acuosa pasará al vaso de precipitados.III.-Precipitación del ADN: En este paso añadimos una capa de etanol sobre la disolución acuosa que contiene el ADN. El ADN posee muchos grupos fosfato por lo que es una molécula muy polar. Debido a esta polaridad, es soluble en agua pero no en alcohol. En la interfase entre ambas soluciones entre ambas soluciones al mezclar suavemente se provoca que el ADN precipite en el etanol y se puedan “pescar” sus largashebras con una pipeta pasteur.





IV.- Efectos del procesado sobre la extracción: Para poder aislar el ADN en forma de filamentos y obtener el ovillo es preciso mantener su integridad. Para comprobar esto realizaremos diversos tratamientos que provocan alteraciones en las fibras de ADN.





Muestra control: Incubamos durante 15 minutos a 55ºC para posteriormente filtrar yprecipitar el ADN con etanol frío.


Tratamiento 1 (fragmentación mecánica): Homogeneizamos durante 2 minutos más, se incuba 15 minutos a 55ºC. Se filtra y precipita el ADN con etanol frío.


Tratamiento 2 (desnaturalización por calor): Incubamos 10 minutos a 100ºC (a ebullición), dejamos en la nevera durante 10 minutos, filtramos y precipitamos el ADN con etanol frío....