Extraccion Adn Levadura

7 Equipamientos
7.1 Cabina de seguridad
7.2 Centrifuga
7.3 Baño Termorregulador
7.4 Micropipetas

8 Materiales y Reactivos
8.1 Tampón 1
8.2 Tampón 2,
8.3 Enzima Liticasa,
8.4 SoluciónSDS 10%,
8.5 Acetato potásico 5M,
8.6 Isopropanol
8.7 Etanol al 70%,
8.8 Solución TE,
8.9 Hielo
8.10 Puntas para cada micropipetas esterilizadas

9 Metodología del ensayo
9.1 Las célulaspueden ser obtenidas de 3 formas distintas dependiendo del su procedencia, si esta proviene de una placa contaminada la cual debe ser aislada se recomienda dejarla crecer en medio liquido YPD por 16horas a una temperatura de 28º C, por otra parte si la células son obtenidas desde una placa de colonias aisladas solo se debe rehidratar en agua como se indica en el punto 9.4,en caso de haber sidoextraída desde la matriz según PTBT 008 continuar en el paso 9.6
9.2 Preparación de la zona de trabajo, según ITM 002
9.3 Utilización de cabina de seguridad, según ITBT 001
9.4 Lavar las células con1 ml de agua destilada
9.5 Centrifugar durante 2 minutos a 10.000 rpm y eliminar el sobrenadante.
9.6 Resuspender el pellet en 0.5ml de Tampón 1.
9.7 Agregar 4,4 μl de Liticasa e incubar lasuspensión durante 60 minutos en un baño a 37ºC.
9.8 Centrifugar durante 10 minutos a 8.000 rpm y eliminar el sobrenadante
9.9 Resuspender el pellet en 0.5ml de Tampón 2.
9.10 Agregar 50 μl de SDS 10%y agitar vigorosamente( ideal con vortex por 2 minutos). Incubar durante 30 minutos a 65ºC.
9.11 Agregar 200 μl de Acetato potásico 5M y agitar bien. Posteriormente, incubar 30 minutos en hielo.9.12 Centrifugar durante 5 minutos a 13.000 rpm.
9.13 Transferir el sobrenadante a otro eppendorf y centrifugar nuevamente para eliminar otras impurezas.
9.14 Transferir el sobrenadante a otro tuboeppendorf y agregar 1ml de Isopropanol, que haya estado guardado a -20ºC aproximadamente. Incubar durante 5 minutos a temperatura ambiente agitándose suavemente.
9.15 Centrifugar durante 10 minutos a...