Extraccion De Adn

PROTOCOLO DE EXTRACCIÓN DE DNA POR SALTING-OUT PARA PEQUEÑOS VOLÚMENES DE SANGRE Autores Riera, Mario A.; Rojas, Maria E.; Zapata, Pedro D. Dirección Laboratorio de Biotecnología Molecular. Módulo de Bioquímica y Farmacia. FCEQyN – UNaM. Av. Mariano Moreno 1375, 3300 Posadas – Misiones – Argentina. Título en inglés A modified salting-out protocol for DNA extraction from small blood sample volumeAbstract A modified salting-out procedure for DNA extraction from decremental blood sample volume was developed (300; 100; 50; 25; 10; 5; 2,5; 1 and 0,5 µL). A 345 bp human prothrombin gene fragment and a STR marker commonly used for filiation analyses (LPL) were then amplified by Polymerase Chain Reaction and visualized in a 6,4% polyacrylamide gel. In all cases the amplification reaction wassuccessful, showing that the DNA extraction method proposed here yields DNA of reasonable purity and quantity from small blood sample volume. Therefore, it is possible to diminish the quantity of sample needed to perform a molecular study, which is fundamental in certain areas such as forensic genetics, where the available sample could be of limited quantity. Key words Blood sample – DNA extraction –salting-out – PCR Resumen Se desarrolló un protocolo modificado de extracción de DNA por salting-out a partir de muestras de sangre con volúmenes decrecientes (300; 100; 50; 25; 10; 5; 2,5; 1 y 0,5 µL). Se llevó a cabo posteriormente una amplificación de un fragmento de 345 pb del gen de la protrombina y de un marcador STR (short tandem repeat) utilizado comúnmente para estudios de filiación,mediante la reacción en cadena de la polimerasa, visualizándose los amplicones en un gel de poliacrilamida al 6,4%. En todos los casos, la reacción de

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amplificación fue exitosa, demostrando así que el protocolo de extracción desarrollado permite obtener DNA en condiciones de pureza y cantidad suficiente a partir de pequeños volúmenes de sangre. De este modo, puede disminuirse la cantidad demuestra necesaria para realizar un estudio molecular, lo cual es fundamental en áreas como la genética forense donde la cantidad de muestra disponible puede ser limitada. Palabras clave Muestras de sangre – extracción DNA – salting-out – PCR Introducción La extracción de DNA a partir de muestras de distinta naturaleza, constituye la etapa previa de todo análisis genético. Obtener DNA relativamentepuro y amplificable resulta fundamental para los posteriores usos a los que será destinado, en el marco de investigaciones de tipo forense, poblacionales, predisposición a enfermedades y otros. Esta tarea demanda una “puesta a punto” de las técnicas de extracción utilizadas, con el objeto de determinar las condiciones ideales en las que se obtendrá un máximo rendimiento. En general; los métodosde extracción de DNA tienen una serie de pasos básicos, que se cumplen independientemente del origen de la muestra. Estos son, a saber: disrupción celular (ruptura de la bicapa lipídica de las membranas celulares por tratamiento con detergentes, agentes quelantes que secuestran cationes estabilizantes de la membrana, etc.), eliminación de las proteínas (que constituyen los principales contaminantesdel extracto), concentración del DNA (por precipitación con alcoholes), lavado (para eliminar restos de reactivos y solventes que puedan inhibir la Taq polimerasa) y resuspensión. (1, 2) Para muestras de sangre en particular, distintos protocolos han sido descriptos y publicados, pudiendo diferenciarse básicamente dos alternativas metodológicas, las cuales difieren en la etapa de la purificaciónde las proteínas del extracto (3, 4). Así podemos encontrar métodos que aprovechan las propiedades desnaturalizantes que tienen ciertos solventes orgánicos como cloroformo, fenol, etc. (1, 3), y a aquellos fundamentados en el conocido cambio de solubilidad que experimentan las proteínas cuando son sometidas a modificaciones en la concentración salina del medio (1, 5). Así, en presencia de bajas...