Extraccion De Celula Cardicaca
Páginas: 6 (1460 palabras)
Publicado: 16 de abril de 2012
Extracción de célula cardiaca
Nombre de la línea celular: Cardiomyocytes Hl-1
Estas células fueron extraídas del músculo cardíaco, designado HL-1, del ratón linaje auricular del tumor cardiomiocitos. Estas no pierden sus características ni capacidad de contraer y retener propiedades morfológicas, bioquímicas y electrofisiológicas.
Este tejido se obtuvo específicamente partir del tumorllamado AT-1 por vía subcutánea los cuales le habían sido extirpados a una hembra adulta de ratón, el cual se obtuvo a partir del animal sacrificado y se recorto cuidadosamente los tejidos conectivos.
El tejido extirpado se desmenuzó y se incubaron a 4 ° C durante 14 h en 0,125% de tripsina en el medio de Joklik con agitación suave.
Las células se obtuvieron mediante digestionessecuenciales.
Se recubrieron los frascos y se incubó a 37 ° C durante la noche.
Las células se mantuvieron en el Ej.-320 de la célula medio (JRH Biosciences, Lenexa, KS) suplementado con 10% de suero fetal bovino (BioWhittaker), 10 mg / ml de insulina (Life Technologies, El medio se cambió cada 24 horas aproximadamente.
Las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2 y 95% de airea una humedad relativa del 95% aproximadamente.
Una vez que las células HL-1 alcanzaron la confluencia, los cultivos de células se dividieron 1 a 3, y esto fue designado como un pasaje. La línea celular HL-1 arrojaron resultados negativos de la contaminación por micoplasma.
La inmunohistoquímica y microscopía confocal.
Por inmunofluorescencia indirecta HL-1 en las células cultivadasen gelatina / fibronectina recubierto con cubreobjetos fueron fijadas con 2,5% de paraformaldehído en PBS (pH 7,2) durante 15 min a 4 ° C y se permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 durante 3 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios utilizados para la tinción de inmunofluorescencia indirecta fueron: anticuerpo monoclonal anti-desmina de Sigma (un catálogo D1033.), Y mAbs MF 20 asarcomérica cadena pesada de miosina (MHC) (amablemente proporcionados por DM Bader, la Universidad de Vanderbilt) y ANF (amablemente proporcionado por CC Glembotski, Universidad de California, San Diego). El anticuerpo secundario era o rodamina o fluoresceína conjugado de cabra anti-IgG de ratón (Sigma). Los cultivos se examinaron en un microscopio confocal Leica escaneado láser equipada con unsistema digital Polaroid captura de imágenes y se registran en Kodak Gold 100 película. Las imágenes se imprimen en color falso.
Microscopía electrónica de transmisión.
Cultivos seleccionados se prepararon para microscopía electrónica in situ como se ha descrito anteriormente ( 14 ). Las células fueron fijadas en el 4,0% glutaraldehyde/0.1 cacodilato de sodio M, postfixed en el 1,0% de osmiocacodilato de sodio tetroxide/0.1 M, monobloque manchada con 0,5% de acetato de uranilo acuoso. Este proceso fue seguido por la deshidratación en una serie gradual de alcohol, con la infiltración y el empotramiento con Polybed 812 plásticos (Polysciences). Secciones delgadas se obtuvieron mediante el uso de un Reichert Ultracut ultramicrótomo equipado con una cuchilla de diamante, se recogió enrejillas de cobre sin recubrimiento 200-malla, poststained con citrato de plomo, y se examinaron en un JEOL 1210 microscopio electrónico de transmisión a 60 kV.
La detección de isoformas de proteínas contráctiles, ANF y connexin43 la expresión génica.
Ensayos de PCR con transcripción inversa (RT-PCR)-basados fueron utilizados para determinar el patrón de expresión génica en el pasaje de 86cultivos de células HL-1. Para cada ensayo, el ARN total fue aislado mediante TRIzol (Life Technologies). RT-PCR se realizó en una mezcla de reacción 60-l que contiene 50 mM de KCl, 10 mM Tris ⋅ HCl (pH 8,4), 2,5 mM de MgCl 2, 20 l / ml de gelatina al 1%, 200 mM de cada dNTP, 100 pmoles de cada oligonucleótido imprimación, 2 unidades de Taq ADN polimerasa, 40 unidades de RNasin, 2 unidades de...
Nombre de la línea celular: Cardiomyocytes Hl-1
Estas células fueron extraídas del músculo cardíaco, designado HL-1, del ratón linaje auricular del tumor cardiomiocitos. Estas no pierden sus características ni capacidad de contraer y retener propiedades morfológicas, bioquímicas y electrofisiológicas.
Este tejido se obtuvo específicamente partir del tumorllamado AT-1 por vía subcutánea los cuales le habían sido extirpados a una hembra adulta de ratón, el cual se obtuvo a partir del animal sacrificado y se recorto cuidadosamente los tejidos conectivos.
El tejido extirpado se desmenuzó y se incubaron a 4 ° C durante 14 h en 0,125% de tripsina en el medio de Joklik con agitación suave.
Las células se obtuvieron mediante digestionessecuenciales.
Se recubrieron los frascos y se incubó a 37 ° C durante la noche.
Las células se mantuvieron en el Ej.-320 de la célula medio (JRH Biosciences, Lenexa, KS) suplementado con 10% de suero fetal bovino (BioWhittaker), 10 mg / ml de insulina (Life Technologies, El medio se cambió cada 24 horas aproximadamente.
Las células se cultivaron a 37 ° C en una atmósfera de 5% de CO 2 y 95% de airea una humedad relativa del 95% aproximadamente.
Una vez que las células HL-1 alcanzaron la confluencia, los cultivos de células se dividieron 1 a 3, y esto fue designado como un pasaje. La línea celular HL-1 arrojaron resultados negativos de la contaminación por micoplasma.
La inmunohistoquímica y microscopía confocal.
Por inmunofluorescencia indirecta HL-1 en las células cultivadasen gelatina / fibronectina recubierto con cubreobjetos fueron fijadas con 2,5% de paraformaldehído en PBS (pH 7,2) durante 15 min a 4 ° C y se permeabilizaron con 0,1% de Triton X-100 durante 3 minutos a temperatura ambiente. Los anticuerpos primarios utilizados para la tinción de inmunofluorescencia indirecta fueron: anticuerpo monoclonal anti-desmina de Sigma (un catálogo D1033.), Y mAbs MF 20 asarcomérica cadena pesada de miosina (MHC) (amablemente proporcionados por DM Bader, la Universidad de Vanderbilt) y ANF (amablemente proporcionado por CC Glembotski, Universidad de California, San Diego). El anticuerpo secundario era o rodamina o fluoresceína conjugado de cabra anti-IgG de ratón (Sigma). Los cultivos se examinaron en un microscopio confocal Leica escaneado láser equipada con unsistema digital Polaroid captura de imágenes y se registran en Kodak Gold 100 película. Las imágenes se imprimen en color falso.
Microscopía electrónica de transmisión.
Cultivos seleccionados se prepararon para microscopía electrónica in situ como se ha descrito anteriormente ( 14 ). Las células fueron fijadas en el 4,0% glutaraldehyde/0.1 cacodilato de sodio M, postfixed en el 1,0% de osmiocacodilato de sodio tetroxide/0.1 M, monobloque manchada con 0,5% de acetato de uranilo acuoso. Este proceso fue seguido por la deshidratación en una serie gradual de alcohol, con la infiltración y el empotramiento con Polybed 812 plásticos (Polysciences). Secciones delgadas se obtuvieron mediante el uso de un Reichert Ultracut ultramicrótomo equipado con una cuchilla de diamante, se recogió enrejillas de cobre sin recubrimiento 200-malla, poststained con citrato de plomo, y se examinaron en un JEOL 1210 microscopio electrónico de transmisión a 60 kV.
La detección de isoformas de proteínas contráctiles, ANF y connexin43 la expresión génica.
Ensayos de PCR con transcripción inversa (RT-PCR)-basados fueron utilizados para determinar el patrón de expresión génica en el pasaje de 86cultivos de células HL-1. Para cada ensayo, el ARN total fue aislado mediante TRIzol (Life Technologies). RT-PCR se realizó en una mezcla de reacción 60-l que contiene 50 mM de KCl, 10 mM Tris ⋅ HCl (pH 8,4), 2,5 mM de MgCl 2, 20 l / ml de gelatina al 1%, 200 mM de cada dNTP, 100 pmoles de cada oligonucleótido imprimación, 2 unidades de Taq ADN polimerasa, 40 unidades de RNasin, 2 unidades de...
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