Extracción de ADN

TÉCNICAS DE EXTRACCIÓN DE ÁCIDOS NUCLEICOS
Biología Celular
Profesora. Martha del Prado

Alexa Zepeda Lora
Universidad la Salle • Química de alimentos • 12 de noviembre 2012

Contenido




INTRODUCCIÓN 2
MACROTÉCNICA SALTING OUT 3
EXTRACCIÓN DE ADN DE MANCHAS DE FLUIDOS ORGANICOS HUMANOS 5
MICROTÉCNICA DE SALTING OUT 6
EXTRACCIÓN DE ADN DE PARASITOS 9
EXTRACCIÓN DE CELULASHUMANAS 10
EXTRACCIÓN A PEQUEÑA ESCALA 11
EXTRACCIÓN DEL ADN DE LAS FRESAS 13
EXTRACCIÓN DE MUESTRAS DE CABELLO SIN BULBO CON RESINA QUELTANTE (Chelex®) 14
EXTRACCIÓN DIFERENCIAL DE ADN A PARTIR DE MUESTRAS ESPERMÁTICAS 16
Bibliografía 19

INTRODUCCIÓN

El ADN fue aislado por primera vez en 1869 por el médico alemán Friedrich Miescher. La sustancia obtenida se encontró solamente en elnúcleo, razón por la que fue originalmente llamada nucleína; posteriormente este término ha sido modificado hasta llegar a su denominación actual de ácido desoxirribonucleico (ADN).
En 1944, Oswald Avery definió el ADN como un vehículo de transferencia generacional de rasgos heredables. En 1953, James Watson y Francis Crick dilucidaron la estructura de la molécula del ADN como una doble hélice, avanceque permitió no solo conocer la naturaleza de la molécula, sino también explicar sus propiedades individuales y su papel en la determinación de características genéticas.
El análisis de la molécula de ADN constituye una herramienta muy valiosa que ha permitido delinear estrategias aplicadas a la investigación básica y al diagnóstico de innumerables entidades de origen genético, basado esto en elprincipio de que la molécula de ADN es única en cada individuo (excepto en los gemelos monocigóticos) y contiene toda la información necesaria para el desarrollo y función de los organismos.
El ADN puede ser extraído de muchos tipos de materiales biológicos (sangre, tejido, hueso, diente, líquido amniótico, etc). Y el éxito del análisis molecular depende de su adecuado aislamiento en términos decantidad, calidad y pureza; es necesario separar el ADN del resto de los componentes celulares así como del material no biológico que pueda estar presente. Los protocolos de extracción buscan, en general, eliminar o diluir potentes inhibidores de reacciones de amplificación (grupos hemo, ADNsas, RNAsas, cristales, etc.) que eviten o dificulten análisis posteriores. Idealmente los procesos deaislamiento deben ser rápidos y fáciles de realizar, garantizado la obtención del material genético aun con pequeñas cantidades de fluidos o tejidos.
El proceso general de aislamiento involucra tres pasos: primero, la lisis de las membranas celulares, mediante el uso del buffer específicos y altas temperaturas; segundo, la degradación de las proteínas por incubación con proteínas K y/o salessaturadas; tercero, la extracción del ADN y su precipitación mediante el uso de alcoholes.


Hay diferentes técnicas que permiten obtener ácidos nucleicos con alto grado de pureza. Sin embargo, muchas aplicaciones de laboratorio no necesitan un grado de pureza tal que justifique incluir estas técnicas, ya porque son caras y/o laboriosas, en los protocolos de purificación. En el caso particular del ARN,la gran abundancia y robustez de las ribonucleasas (enzimas que degradan específicamente ARN) celulares y de posibles contaminaciones ambientales, hace necesarios métodos y precauciones especiales. Estos incluyen la utilización de agentes fuertemente desnaturalizantes, o inhibidores específicos, que inactiven tales ribonucleasas. Debido a todo esto, solo se hablaré purificaciones de ADN.MACROTÉCNICA SALTING OUT

Procedimiento
Colocar 2.5 ml de sangre total anticoagulada con EDTA, en un tubo Falcon de 15 ml y adicionar 5 ml de solución de lisis para eritrocitos
Incubar la muestra en hielo por 20 minutos, mezclando inicialmente manera suave. Centrifugar luego durante 10 minutos a 5.000 rpm.
Descartar el sobrenadante y resuspender la pastilla de leucocitos en 3ml de solución...