Footprinting

Técnicas de análise de DNA e RNA

Fundamento e aplicação das técnicas de análise de DNA
• Extracção, purificação, quantificação e detecção de ácidos nucleicos
• Electroforese convencional em gel de agarose
• Electroforese em gel de campo pulsado (PFGE)
• Hibridação Southern, hibridação dot-blot e hibridação in situ
• Sequenciação de DNA
• Footprinting de DNA
• Retardação em gel
•Mutagénese de DNA

Extracção, purificação, quantificação e detecção de ácidos nucleicos
Extracção e purificação de ácidos nucleicos – Utilização de Kits comerciais
Quantificação de ácidos nucleicos
Método espectrofotométrico (A concentração de DNA é medida pela absorção a 260 nm, sendo
uma absorvância de 1,0 equivalente a 50 µg/ml de DNA de cadeia dupla.)
Método baseado na fluorescência dobrometo de etídio (Comparação com a fluorescência de
amostras de DNA de concentração conhecida.)

Detecção de ácidos nucleicos
Coloração com brometo de etídio
Coloração com nitrato de prata
Métodos de detecção não radioactivos na hibridação de ácidos nucleicos
Marcação das sondas in vitro com:
Corantes fluorescentes ou fluoróforos (fluoresceína e rodamina)
Biotina ou digoxigenina (através deligandos de afinidade – avidina, estreptavidina ou
anticorpo anti-digoxigenina - acoplados a uma enzima de sinalização que converte os
substratos em produtos corados ou quimioluminescentes)
Enzimas (fosfatase alcalina – AP ou peroxidase de rábano silvestre – HRP)

Métodos de detecção radioactivos na hibridação de ácidos nucleicos
Marcação das sondas in vitro com 32P
Marcação interna (Nicktranslation, Random primers, PCR)
Marcação terminal 5´ou 3’

Electroforese em gel convencional (1)

Electroforese em gel convencional (2)
A técnica de electroforese em gel permite a separação de fragmentos de DNA de
dimensões diferentes
A matriz de gel (ovais laranja) consiste em longas cadeias de polímeros, entrelaçadas. A
dimensão das cadeias interligadas, ou poros, depende daconcentração de agarose ou de
acrilamida utilizada no gel.

Os poros nos géis de agarose são maiores do que nos géis de acrilamida. Os primeiros
são utilizados para separar fragmentos grandes de DNA (≈500 pb a ≈20 kb) e os últimos para
separar fragmentos pequenos de DNA (1 nucleótido a ≈2 kb).

Sob a acção da corrente eléctrica que passa através do gel os fragmentos são separados,
movendo-se para opólo positivo a uma taxa inversamente proporcional ao logaritmo da
sua dimensão, formando bandas que são visualizadas por auto-radiografia (fragmentos
radioactivos) ou pela adição de um corante fluorescente, como por exemplo o brometo de
etídio.

Os géis de agarose são horizontais, mas os de acrilamida são verticais (preparados entre
duas placas de vidro com um afastamento de algunsmilímetros apenas) porque o oxigénio do
ar inibe a polimerização da acrilamida.

Electroforese em gel de campo pulsado (PFGE) (1)

A técnica de electroforese em gel de campo pulsado – PFGE é utilizada para separar cromossomas
diferentes, como por exemplo de Saccharomyces cerevisiae, cujas dimensões variam entre 220 000 a
2,5 milhões de pares de nucleótidos, ou moléculas de DNA com 107 pares denucleótidos. O DNA é
corado com brometo de etídio.

Electroforese em gel de campo pulsado (PFGE) (2)

Definição das condições: Nº de fases; duração dos pulsos; duração de cada fase; amperagem.
Exemplo: Fase 1; pulso 1 segundo; duração da fase 36 minutos; 180 mA
Fase 2; pulso 2 segundos; duração da fase 36 minutos; 180 mA

Hibridação Southern e hibridação Northern (1)

As técnicas dehibridação Southern e hibridação Northern
permitem, respectivamente, a detecção de DNAs ou de RNAs
específicos por hibridação com sondas apropriadas, de DNA e
RNA.
Neste exemplo, a sonda de DNA é detectada pela sua
radioactividade, mas as sondas também podem ser detectadas por
métodos não radioactivos.

Hibridação Southern e hibridação Northern (2)
Estas técnicas envolvem as seguintes...