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Trabajo Práctico nº 9: Fotosíntesis.
Cadena del transporte de electrones en cloroplastos de espinaca


# Objetivos:
- Visualizar el transporte de electrones cloroplástico bajo distintas condiciones de incubación de un extracto crudo de hojas.
- Comprender el funcionamiento de las reacciones redox del transporte de electrones fotosintético utilizando un aceptor artificial de electrones.# Fundamento
Los cloroplastos catalizan el transporte de electrones dependiente de luz desde el agua hasta un aceptor, el NADP+. Los componentes de la cadena de transporte de electrones fotosintéticos se encuentran incluidos asimétricamente en la membrana tilacoide. Cada fotosistema en presencia de luz reduce a su aceptor primario y oxida a su dador primario.
El PSII toma electrones delagua, la que es oxidada a O2 en el proceso denominado “fotólisis del agua” y los cede a la plastoquinona. El PSI toma electrones de la plastocianina y los cede a la ferredoxina. La ferredoxina es a su vez oxidada por la ferredoxina NADP+ oxidorreductasa para reducir al NADP+. Los dos fotosistemas (PSII y PSI) están conectados en serie por el complejo de citocromo b6-f.
La ferredoxina-NADP reductasa (la enzima Terminal del transporte de electrones fotosintético) puede reducir distintos aceptores artificiales de electrones como el metilviológeno y el ferricianuro de potasio, además del NADP+. A su vez, el PSII también puede utilizar aceptores externos artificiales de electrones, como el 2,6-dicloro fenol indofenol (DCPIP). Este último compuesto presenta la ventaja de ser de color azul (a pHneutro) cuando está oxidado, mientras que es incoloro en la forma reducida, lo que permite seguir espectrofotométricamente el curso de la reacción de reducción.
La atrazina compite con QB por el sitio en PSII.

1- Preparación de cloroplastos

Se lavaron 0,5g de hojas de espinaca con agua destilada. Luego se les quito las nervaduras, se las secó y mortereó con 4 ml de buffer en frio. Acontinuación se filtró el homogenado y se lo dividió en dos tubos eppendorf mantenidos en hielo. Se procedió con una centrifugación refrigerada, para luego descartar el sobrenadante y resuspender el pellet (que contenía los cloroplastos) con buffer de ruptura. Se conservaron los tubos en frío hasta su utilización

2- Visualización del transporte de electrones bajo distintas condiciones

Se prepararon 5tubos de acuerdo al siguiente protocolo. Se mantuvieron todos los tubos con buena iluminación, con excepción del 3 que se sometió a un periodo de oscuridad, para luego ser llevado a la luz. Finalmente se medirá absorbancia a 600 nm (εDCPIPox= 21 mM-1 cm-1) llevando a cero con H2O destilada, a tiempo 0, 5 y 10 minutos.
Agregados (ml)
Tubo

1
2
3*
4
5
Buffer de Ruptura
5
5
5
5
5Atrazina (6 mM)
----
----
----
----
0,05
NH4Cl (0,3 M)
----
----
----
0,16
----
DCPIP (10 mM)
0,15
0,15
0,15
0,15
0,15
Cloroplastos
----
0,01
0,01
0,01
0,01
Luz
+
+
-
+
+


# Resultados:

Tubos
Buffer de ruptura (ml)
Atrazina 6mM(ml)
NH4Cl 0,3M (ml)
DCPIP 10mM (ml)
Cloroplastos (ml)
Volumen Final
(ml)
1
5
-
-
0,15
-
5,15
2
5
-
-
0,15
0,01
5,163*
5
-
-
0,15
0,01
5,16
4
5
-
0,16
0,15
0,01
5,32
5
5
0,05
-
0,15
0,01
5,21
* Tubo que se expondrá a un periodo de oscuridad (Tubo 3osc) y luego a la luz (Tubo 3luz)

Abs 600nm
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3osc
Tubo 3luz
Tubo 4
Tubo 5
t=0
0,568
0,568
0,588
----
0,560
0,563
t=5
0,456
0,413
0,153
0,153
0,072
0,147
t=10
0,138
0,048
----
0,098
0,018
0,144Velocidad (ΔAbs/min)
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3osc
Tubo 3luz
Tubo 4
Tubo 5
Vt
-0,043
-0,052
-0,087
-0,011
-0,054
-0,042

Moles DCPIPox (nmoles/min)
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3osc
Tubo 3luz
Tubo 4
Tubo 5
Ct
10,5
12,8
21,4
2,7
13,7
10,4

Flujo de e- (nmoles/min)
Tubo 1
Tubo 2
Tubo 3osc
Tubo 3luz
Tubo 4
Tubo 5
Ft
21
25,6
42,8
5,4
27,4
20,8


# Cálculos:

Cálculo de la...