fundamentos de la polimerasa


INFORME DE LABORATORIO
¨FUNDAMENTOS DE LA REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR) ¨
¨ FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS¨

PRACTICA Nº 9

DOCENTE:Rafael Alvis Dávila

INTEGRANTES: Carla Manrique
Jorge Varela
Bruno Díaz


CARRERA: Medicina Humana

FECHA DE ENTREGA: 24 de junio de 2014


INTRODUCCIÓN
PCR
La Reacción en cadena de la polimerasa, PCR se fundamenta en la amplificación enzimática de un fragmento de ADN flanqueado por dos secuencias deoligonucleótidos que hibridan en la cadena complementaria de la molécula molde que se va a amplificar (cebadores o “primer”) Y que son utilizados por una ADN polimerasa termoresistente para copiar la secuencia de la misma.
La reacción es un proceso que consta de 3 etapas: desnaturalización, hibridación y extensión.

Desnaturalización: Para que pueda iniciarse la reacción es preciso que lasmoléculas de ADN molde se encuentren en forma de cadena simple. Esto se consigue calentando a temperatura de 90 a 95ºC para que produzca la rotura de los enlaces puente de hidrogeno intercatenarios y la separación de ambas cadenas, para asegurar la completa separación de la doble cadena del ADN esta temperatura debe mantenerse unos minutos. Si el ADN solo se desnaturaliza parcialmente éste tenderá arenaturalizarse muy rápidamente dificultando con esto el proceso de hibridación.

Hibridación: Una vez que el ADN está desnaturalizado se disminuye la temperatura de la reacción hasta un rango comprendido entre los 40 y los 60ºC para que se pueda producir la hibridación específica de los cebadores a las secuencias flanqueantes del fragmento que se desea amplificar, la temperatura a la que serealiza esta etapa debe establecerse para cada reacción en función de la longitud de los cebadores y su secuencia (Temperaturas inferiores a la óptima nos producirán hibridaciones inespecíficas de los cebadores y temperaturas superiores nos dificultarán la eficiencia de la misma.
Extensión: Durante esta etapa la ADN polimerasa termoresistente incorpora nucleótidos en el extremo 3´ del cebadorutilizado como molde la cadena de ADN previamente desnaturalizada.
La temperatura a la que se realiza esta etapa de la reacción suele ser de 72ºC ya que es la temperatura a la que la “Taq polimerasa” alcanza su máxima actividad. Normalmente una extensión de 20 segundos es suficiente para fragmentos menores de 500 pares de bases, y 40 segundos para fragmentos por encima de 1.2Kb.Al finalizar cada uno delos ciclos el número de copias obtenidas se duplica y después de 20 ciclos ya tenemos aproximadamente 1 millón de copias de cada una de las moléculas molde iniciales
ADN.
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Los sitios de restricción son secuencias específicas de una molécula de DNA que son dianas para el corte por una ENZIMA DE RESTRICCIÓN. En esta figura, una molécula circular de 6,8 kb (un plásmido)tiene dos sitios de reconocimiento para una enzima concreta y es atacada por moléculas de esa enzima. Cada molécula de enzima es capaz de cortar muchas moléculas de plásmido.
El producto de la digestión completa (el corte en ambos sitios o dianas) es una pareja de fragmentos, en este ejemplo con tamaños de 5,5 kb y 1,3 kb.
da fragmento resultante de la digestión del DNA con la enzima derestricción es parte de la muestra, una mezcla contenida en un tubo Eppendorf.
A la muestra incolora se le añade un colorante azul y se carga en un gel de agarosa para realizar la electroforesis.
FUNDAMENTOS DE ELECTROFORESIS
La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga...