Gene Clean
Páginas: 5 (1120 palabras)
Publicado: 4 de mayo de 2012
Universidad Interamericana de Puerto Rico
Recinto Metropolitano | |
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“Gene Clean”
EL “gene clean” es una técnica empleada para la purificación del producto de “PCR” de un gel de agarosa. Una vez obtenido los resultados de una electroforesis, las bandasde interés deben ser aisladas. Existen diversos kits en el mercado que pueden llevar a cabo la purificación, sin embargo la técnica empleada resulta costo efectiva. La purificación consiste primeramente en aislar y fundir la banda cortando la menor cantidad posible de agarosa. Finalmente, extraer y purificar el ADN con una serie de pasos sucesivos precipitando con etanol y sales. En la técnicaempleada se utilizo un microtubo con su fondo perforado previamente y con pelo de ángel en su interior. Este tubo será colocado sobre un tubo ependdorf con el fin de filtrar el material atrapado en la agarosa e impidiendo el paso de la misma. El ADN de la muestra en la agarosa es diluido aplicando NaCl, etanol y agua respectivamente y centrifugando luego de cada aplicación. Finalmente se utiliza elespectrofotómetro con el fin de determinar pureza, cantidad y concentración de ADN. Nuestra muestra de la planta Ruda obtuvo una concentración de 20ug del ADN. La concentración de ADN fue elevada lo que es indicativo de impurezas presentes en la muestra (etanol, fenol, sales, RNA entre otros). Esto puede provocar que falle la reacción de secuenciación en un futuro, sin embargo, el margen deerror de los espectrofotómetros debe ser considerado.
Tabla de Contenido
Introducción 3
Materiales y Métodos 4
Resultados 6
Discusión 7
Conclusión 8
Referencias 9
Purificación del Producto de PCR
Introducción
El “gene clean” es una técnica que simplifica elproceso en la purificación de ADN obtenido en el gel de agarosa “TAE buffer”. Una vez se realiza la electroforesis el siguiente paso es la aplicación de esta técnica la cual sigue tres pasos principales: unir, lavar y enjuagar. Durante el primer paso es importante la concentración de sal y el pH. El lavado se hace con etanol y se debe tomar en consideración la cantidad utilizada ya que puedeinterferir en la elución del ADN. Finalmente, el sobrenadante resultante de la elución del ADN se debe dejar secar al menos 5 minutos para que el etanol se elimine completamente. Con la aplicación de esta técnica se logran los siguientes objetivos:
• Aislar los ácidos nucleicos de la gel de agarosa
• Remover sales
•Eliminar las proteínas de las reacciones enzimáticas.
• Remover “primers” y nucleótidos no incorporados de las reacciones enzimáticas.
• Aislar el producto de PCR del ADN genómico.
Existen diversos kits ya preparados para realizar esta técnica de manera eficiente y en alguno de ellos sin etanol sin embargo utilizamos un protocolo costoeficiente.
Materiales y Métodos
Luego que obtuvimos los resultados de la electroforesis (figura 1) aislamos el gen de interés cortando la agarosa. De esta manera comenzamos el procedimiento de purificación.
[pic]
Figura 1. Resultados electroforesis con producto del PCR.
El pedazo de agarosa cortado de las muestras de Arabidopsis, pGap yRuda lo colocamos en un microtubo de 0.5ml con su fondo previamente perforado y con pelo de ángel (figura 2) en su interior. Los microtubos se colocaron cada uno en un tubo más grande.
[pic]
Figura 2. Pelo de ángel (“glass fiber”) utilizado como filtro.
Con los tubos ya preparados comenzamos el proceso del aislamiento del plasmidio. Se pesó el producto final para conocer cuanta...
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“Gene Clean”
EL “gene clean” es una técnica empleada para la purificación del producto de “PCR” de un gel de agarosa. Una vez obtenido los resultados de una electroforesis, las bandasde interés deben ser aisladas. Existen diversos kits en el mercado que pueden llevar a cabo la purificación, sin embargo la técnica empleada resulta costo efectiva. La purificación consiste primeramente en aislar y fundir la banda cortando la menor cantidad posible de agarosa. Finalmente, extraer y purificar el ADN con una serie de pasos sucesivos precipitando con etanol y sales. En la técnicaempleada se utilizo un microtubo con su fondo perforado previamente y con pelo de ángel en su interior. Este tubo será colocado sobre un tubo ependdorf con el fin de filtrar el material atrapado en la agarosa e impidiendo el paso de la misma. El ADN de la muestra en la agarosa es diluido aplicando NaCl, etanol y agua respectivamente y centrifugando luego de cada aplicación. Finalmente se utiliza elespectrofotómetro con el fin de determinar pureza, cantidad y concentración de ADN. Nuestra muestra de la planta Ruda obtuvo una concentración de 20ug del ADN. La concentración de ADN fue elevada lo que es indicativo de impurezas presentes en la muestra (etanol, fenol, sales, RNA entre otros). Esto puede provocar que falle la reacción de secuenciación en un futuro, sin embargo, el margen deerror de los espectrofotómetros debe ser considerado.
Tabla de Contenido
Introducción 3
Materiales y Métodos 4
Resultados 6
Discusión 7
Conclusión 8
Referencias 9
Purificación del Producto de PCR
Introducción
El “gene clean” es una técnica que simplifica elproceso en la purificación de ADN obtenido en el gel de agarosa “TAE buffer”. Una vez se realiza la electroforesis el siguiente paso es la aplicación de esta técnica la cual sigue tres pasos principales: unir, lavar y enjuagar. Durante el primer paso es importante la concentración de sal y el pH. El lavado se hace con etanol y se debe tomar en consideración la cantidad utilizada ya que puedeinterferir en la elución del ADN. Finalmente, el sobrenadante resultante de la elución del ADN se debe dejar secar al menos 5 minutos para que el etanol se elimine completamente. Con la aplicación de esta técnica se logran los siguientes objetivos:
• Aislar los ácidos nucleicos de la gel de agarosa
• Remover sales
•Eliminar las proteínas de las reacciones enzimáticas.
• Remover “primers” y nucleótidos no incorporados de las reacciones enzimáticas.
• Aislar el producto de PCR del ADN genómico.
Existen diversos kits ya preparados para realizar esta técnica de manera eficiente y en alguno de ellos sin etanol sin embargo utilizamos un protocolo costoeficiente.
Materiales y Métodos
Luego que obtuvimos los resultados de la electroforesis (figura 1) aislamos el gen de interés cortando la agarosa. De esta manera comenzamos el procedimiento de purificación.
[pic]
Figura 1. Resultados electroforesis con producto del PCR.
El pedazo de agarosa cortado de las muestras de Arabidopsis, pGap yRuda lo colocamos en un microtubo de 0.5ml con su fondo previamente perforado y con pelo de ángel (figura 2) en su interior. Los microtubos se colocaron cada uno en un tubo más grande.
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Figura 2. Pelo de ángel (“glass fiber”) utilizado como filtro.
Con los tubos ya preparados comenzamos el proceso del aislamiento del plasmidio. Se pesó el producto final para conocer cuanta...
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