Genetica molecular: clonación i southern-blot

CLONACIÓ

La clonació molecular es refereix al procés d’aïllar una seqüència específica de DNA (gens o altres seqüències del genoma), insertar-la dins un vector (plasmidi, bacteriòfag...) i obtenir múltiples còpies de ella en un organisme transformant (generalment procariota) gràcies a la divisió d’aquest i formant colònies portadores del vector.

L’objectiu de la pràctica ésclonar una seqüència de DNA de 0.9 Kb que pertany al gen white de Drosophila melanogaster, la seqüència del qual es troba insertada al plasmidi pWXK (Fig. 1), i volem insertar el fragment de 0,9 Kb al vector pBSK (Fig.2) utilitzant l’enzim de restricció Sal I. Llavors transformarem les cèl·lules d’Escherichia coli (amb tots els controls corresponents) amb el fragment incorporat per obtenir els clons.Fig. 1. Plasmidi pWXK. Plasmidi de 7.7 Kb que conté el fragment de 0.9 Kb dins del gen white de Drosophila melanogaster de 4.8 Kb. Observem els tres fragments resultants de digerir amb l’enzim Sal I.

Fig. 2. Vector pBSK. Vector de clonació de 2.9 Kb . Amb una regió MCS (multi clonning site) on es troben les dianes reconegudes per enzims de restricció de manera específica, entre elles la deSal I. En aquesta regió incorporarem el nostre insert.
També cal destacar la presencia de dos marcadors corresponents a un gen de resistència a ampicil·lina i un gen Lac Z, el qual conté a la regió MCS.

MATERIAL, MÈTODES i RESULTATS:

EXTRACCIÓ DE DNA (MINIPREP)

Per poder extreure el DNA del plasmidi i del vector corresponents, utilitzem una tècnica anomenada miniprep, queconsisteix en una lisi alcalina.

A partir de cultius de nit en medi ric (TB) de la soca amb el plasmidi pWXK i la soca portadora del vector pBSK, que amb una centrifugació obtenim només les cèl·lules, procedim a la extracció utilitzant tres solucions:

- Primer, el tampó de lisi cel·lular: format per glucosa, EDTA i Tris.Cl; pH 8,0.
La glucosa controla el pH. És una solució hipotònica i,per tant, provoca una entrada d’aigua a la cèl·lula fins que lisa.
- Segon, la solució de desnaturalització: formada per NaOH i SDS.
El SDS solubilitza en part la membrana externa de les bactèries Gram negatives, el que produeix la alliberació del contingut cel·lular d’aquestes: DNA genòmic i plasmídic desnaturalitzats, RNA, proteïnes..., el NaOH augmenta molt el pH desnaturalitzant el DNA.- Tercer, el tampó de neutralització: format per acetat potàssic, àcid acètic glacial i H2O.
Neutralitza tot el contingut cel·lular i provoca una renaturalització del DNA plasmídic ajudat per la disminució paulatina del pH. El DNA plasmídic queda en suspensió, mentre que el genòmic forma agregats amb l’acetat potàssic, i juntament amb la resta de components, precipiten.

Un copfinalitzats aquests passos tenim: DNA plasmídic i RNA, el qual haurà de ser eliminat per una RNAasa, però abans guardarem una part de la mostra per posar una electroforesis de comprovació posteriorment.
Com que es probable que quedin restes de proteïnes, afegirem primerament fenol per desproteïnitzar la mostra, i després cloroform-isoamilalcohol, que eliminarà les restes de fenol i proteïnes que haginquedat.
Seguidament realitzarem una electroforesi de comprovació (Fig. 3) per saber la quantitat de DNA, tant del plasmidi pWXK com del vector pBSK, he obtingut en la extracció.

Fig. 3. Electroforesi comprovació
Podem observar tres regions en l’electroforesi.
- Regió superior: distingim en el primer pouet el marcador Pm λ-BstE II, encara que les bandes del marcador no sónsuficientment clares. A partir d’aquí observem el recorregut del vector pBSK + RNAasa (primer carril de cada grup) i el control pBSK sense RNAasa (segon carril de cada grup).
Pel que fa als carrils corresponents al pBSK + RNAasa és representada en tots els grups una banda superior més o menys nítida corresponents a la quantitat del DNA i una banda inferior que representa el RNA.
La gran...