GUIA DE PROBLEMAS Gen Tica Molecular

GUIA DE PROBLEMAS
BIBLIOTECAS Y TÉCNICAS DE HIBRIDACIÓN

PROBLEMA 1
A partir de una biblioteca genómica de T. cruzi construida en cósmidos (30.000 pb), se
realizó un rastreo para detectar genes de mucinas con una sonda de un gen completo de
mucina de mamíferos. Se obtuvieron varios clones positivos y se decidió realizar otra
biblioteca a partir de uno de los cósmidos positivos en fragmentos detamaños entre
2000-3000pb en el vector pBS. Para esto se eligió hacer una fragmentación mecánica
del cósmido.
1. Considerando que las mucinas de mamíferos tienen un 80% de homología con las de
T. cruzi ¿en qué condiciones se habrá realizado el rastreo de la biblioteca de cósmidos?
2. ¿Qué ventajas y desventajas tiene la estrategia elegida para la construcción de la
biblioteca en vector pBS?
3.¿Cómo seleccionaría los tamaños de insertos dentro del rango de tamaño deseado?.
¿Qué tipo de enzima usaría para digerir el vector y cómo prepararía los insertos para
ligar?
4. ¿Cuántos clones se necesitarán para tener representado todo el cósmido al menos una
vez?

PROBLEMA 2
Con el objetivo de aislar del genoma de A. tumefaciens el gen que codifica la proteína
X, se realizó un rastreo de unabiblioteca genómica de expresión realizada en cósmidos.
La biblioteca fue construída por digestión parcial del genoma de A. tumefaciens con la
enzima de restricción EcoR1, de modo de obtener fragmentos de aproximadamente
25000pb, que luego fueron ligados al cósmido digerido por EcoR1. El rastreo se realizó
por hibridización con una sonda obtenida por PCR sobre el gen completo de R. meliloti
(organismoaltamente relacionado con A. tumefaciens).
Como resultado del rastreo se identificaron 3 colonias positivas. Los cósmidos
correspondientes a cada una de estas colonias fueron purificados y digeridos con EcoR1
obteniéndose el siguiente patrón de digestión por electroforesis en gel de agarosa:
La mezcla de digestión (sin distinguir los fragmentos) de cada cósmido se clonó en un
vector pY y cada uno fuetransferido a bacterias mutantes de A. tumefaciens, defectivas
en la proteína X, para ver si complementan la mutación. Unicamente se observó
complementación en las mutantes transformadas con los cósmidos A y C.
1. Explique los resultados obtenidos.
2. De acuerdo a los resultados, ¿qué fragmento contendría el gen completo?
3. ¿Qué estrategia seguirá para clonar el gen completo?

PROBLEMA 3
Ustedestá estudiando las mucinas de Trypanosoma carasii, que forman la cubierta de
este parásito unicelular. Las mucinas purificadas de acuerdo a criterios bioquímicos son
muy heterogéneas, indicando la coexistencia de múltiples mucinas distintas en la
superficie (usted sospecha la presencia de al menos 100 proteínas distintas expresadas
simultáneamente). Por otro lado, otro grupo publicó la secuencia delos primeros 5
genes de mucinas de T. carasii y demostraron que todos ellos tienen una estructura
común, codificando para productos con un segmento N-terminal muy conservado (95%
de identidad) de 100 amino ácidos y un segmento C-terminal altamente variable
(homologías menores al 25% entre cualquier par de genes) de entre 50 y 100 amino
ácidos. En ese mismo trabajo, sus competidores publican unSouthern blot hecho en
condiciones de máxima rigurosidad que revela una complejidad genómica altísima para
la familia.
1. Dados los antecedentes y el resultados del Southern blot, ¿Cuál le parece que habrá
sido la sonda utilizada en este ensayo?
2. ¿Cómo estimaría con la mayor precisión posible el número de genes que codifican
para la familia de mucinas en este parásito? (usted cuenta con todas lasherramientas de
biologia molecular, DNA genómico de T. carasii en cantidad ilimitada, anticuerpos
contra las mucinas purificadas, una biblioteca de expresión de T. carasii de 3 kpb de
inserto promedio y una biblioteca genómica de T. carasii de 20 kpb de tamaño de
inserto promedio). El genoma de T. carasii consta de 5x106 pb.

PROBLEMA 4
En un laboratorio se está intentando aislar un gen...