Hplc

HPLC
Cromatografía liquida de alta resolución (HPLC)
 
Fundamentos y principios básicos
El HPLC (HIGH PERFORMANCE LIQUID CROMATOGRAPHY) o Cromatografía liquida de alta resolución, es una técnica cromatográfica usada para separar componentes usando una variedad de interacciones químicas entre el analito y la columna cromatográfica.
Básicamente es un sistema compuesto de un reservorio de fasemóvil, bomba, inyector, columna de separación y detector.
El analito se pasa a través de una columna de la fase estacionaria bombeando la fase móvil liquida con alta presión. La muestra se introduce en pequeños volúmenes a la corriente de la fase móvil y allí se retarda por medio de interacciones químicas con la fase estacionaria mientras atraviesa la columna.
El retardo se conoce como tiempo deretención, único para analito. Depende de la naturaleza del analito, de la fase estacionaria y de la composición de la fase móvil.
Los solutos mas comunes usados en la fase móvil son combinaciones de agua purificada con líquidos orgánicos, los mas comunes son Metanol y Acetonitrilo, también suelen usarse sales y bufferes para contribuir a la separación de componentes. También se usa el AcidoTrifluoroacetico para actuar como
formador de pares iónicos.
Estas combinaciones introducen el concepto de gradiente de elución. Consiste en la variación de la composición de la fase móvil, para adaptarse a los diferentes analitos y conseguir mejores resultados. El gradiente separa la matriz del analito en función de la afinidad del analito por la composición de la fase móvil. Cada analito tiene ungradiente de elución óptimo para obtener la máxima separación de picos en el detector.

Existen varios tipos de HPLC:

Cromatografía de fase normal:
 
Fue el primer tipo de HPLC, separaba analitos basándose en la polaridad. Este método usa una fase estacionaria polar y una fase móvil no polar que se usa cuando el analito es polar. El analito polar es retenido por la fase estacionaria polar.La adsorción aumenta con la polaridad del analito y la interacción
entre analito y fase estacionaria. Esto incrementa el tiempo de elución. La fuerza de interacción depende no solo de los grupos funcionales, sino también de factores estéricos e isómeros estructurales.
El uso de disolventes polares disminuye el tiempo de retención, mientras que disolventes hidrófobos aumentan el tiempo deretención. Algunos solutos polares interaccionan con la fase estacionaria y desactivan la columna.

Cromatografía de fase inversa
Este tipo de HPLC es el más común. En esta técnica se usa una fase estacionaria no polar y una fase móvil moderadamente polar.
La fase estacionaria típica es silicio tratado con RMe2 SiCl, donde R es una cadena lineal con un grupo alcalino.
 
La adición de disolventespolares incrementa el tiempo de retención y añadir disolventes hidrofóbicos lo disminuyen. El tiempo de retención es mayor para moléculas no polares.
El principio básico de este método esta basado en las interacciones del disolvente polar, el analito no polar y la fase estacionaria no polar.
Las características del analito son importantes para sus propiedades de retención. Las moléculas muygrandes pueden causar que la interacción no sea completa. El tiempo de retención aumenta con el área hidrofobicidad, que es inversamente proporcional al tamaño del soluto. Los componentes ramificados eluyen más rápido por que el área total esta disminuida.
Hay otros modificadores de la fase móvil que afectan a la retención del analito. Añadir sales inorgánicas causa incremento lineal en la tensiónsuperficial de soluciones acuosas, incrementando el tiempo de retención.
El pH también es importante porque modifica la hidrofobia del analito. Por eso se suele usar un buffer como fosfato sódico para controlar el pH. Un ácido orgánico como ácido fórmico o ácido trifluoracetico. Sirven para muchas cosas, controlan el pH, neutralizan cualquier carga residual del silicato en la fase estacionaria y...