IBCM

Resumen:
El presente trabajo práctico consistió el desarrollo de dos técnicas frecuentemente utilizadas en tecnologías de DNA recombinante, mas específicamente en el clonado de DNA, el miniprep y la electroforesis. Luego de llevar a cabo el protocolo correspondiente a la purificación por miniprep se obtuvo valores aproximados para las concentraciones de ácidos nucleicos y proteínas, y seconsidero su relación como criterio de pureza. Asimismo luego de la corrida electroforética se pudo comprobar la presencia del DNA plasmídico de interés en las muestras de una gran proporción de los grupos.
Introducción
La tecnología del DNA recombinante, incluye diversas técnicas entre las cuales se encuentra el “clonaje de DNA”. Esta consiste en el aislamiento de un fragmento de DNA y su posterioramplificación, que puede realizarse de diferentes formas. La mas sencilla involucra la inserción de un fragmento de DNA de interés en el genoma purificado de un elemento genético autoreplicativo, por lo general un virus o un plásmido. Este último es una pequeña molécula de DNA de doble cadena extracromosómica, presente en bacterias y en algunos organismos eucariotas, que se replica de formaindependiente del genoma. Durante la división celular, se segregan copias del DNA plasmídico a cada célula hija, lo cual asegura la propagación continua del plásmido a través de generaciones sucesivas de la célula huésped. En la actualidad la clonación de DNA se realiza sobre todo con vectores plasmídicos bacterianos. Estos son plásmidos a los cuales se le realizan modificación como la eliminación deporciones no necesarias que surgen naturalmente y producen vectores de ""1,2-3 Kb de longitud de circunferencia, que contienen tres regiones esenciales para la clonación del DNA: un origen de replicación; un marcador que permite la selección, casi siempre un gen de resistencia a fármacos; y una región en la cual se pueden insertar los fragmentos exógenos de DNA. Por lo general suponen una pequeñaparte del total del DNA por lo cual se pueden separar fácilmente gracias a su menor tamaño respecto a las moléculas de DNA cromosómico.
Un método utilizado comúnmente para la posterior separación de los demás componentes celulares y concentración del DNA plasmídico, es una técnica llamada Miniprep. Mediante el tratamiento del cultivo con diferentes compuestos (que desestabilizan la estructurasbacterianas y generan cambios de pH y fuerza iónica en el entorno) y fundamentándose en las propiedades diferenciales que poseen el DNA plasmídico y el DNA cromosómico conferidas por su diferencia de tamaño, logra purificar parcialmente el DNA de interés.
A fin de comprobar la pureza de la muestra obtenida, se puede realizar una espectrofotometría mediante la cual se mide la densidad óptica (OD)con una cierta longitud de onda ya conocida para el compuesto de interés y se obtiene la proporción de muestra presente del mismo. Así, sabiendo que los ácidos nucleicos corresponden a 260nm y las proteínas a 280nm, se puede considerar su relación (OD 260nm/OD 280nm) como criterio de pureza respecto a contaminantes de origen proteico, siendo el rango tolerable de 1,6 a 2. Es conveniente considerarque la concentración real de DNA, en ug/ul de muestra, será 10 veces la lectura de OD. Por ejemplo, si la OD de la muestra diluida es 0,2 a 260 nm, la muestra original contiene 2 ug/ul de DNA.
Para la visualización de los componentes remanentes en la muestra ya purificada una técnica frecuentemente emplea es la electroforesis. Esta consiste en hacer correr a través de un gel (de agarosa opoliacrilamida generalmente) una porción de la muestra aplicando una diferencia de potencial y separando los componentes tanto por su peso molecular (en el tamiz del gel), su forma y su carga.
Durante la extracción, la preparación y la conservación del DNA plasmídico, es frecuente que tengan lugar algunos cortes en una sola hebra de las moléculas superenrolladas (covalentemente cerrada). El plásmido...