Informe "Actividad enzimatica de la β-galactosidasa a distintas temperaturas"

Universidad de Chile
Facultad de Ciencias
Escuela de Pregrado
Biología General


Trabajo Práctico N° 2
"Actividad enzimática de la β-galactosidasa a distintas temperaturas"












I. Resumen
El objetivo de este práctico, consiste en comparar la actividad enzimática, usando dos temperaturas diferentes, de la β-galactosidasa, una enzimaexoglicosidasa, ampliamente usada en la producción láctea y en el campo de la investigación genética, que cataliza la hidrólisis y ruptura del enlace o-glucosídico en β-galactósidos, obteniendo galactosa y otro resto orgánico. Para ello se utilizó una cantidad constante orto-nitrofenil β-galactosido (ONFG), utilizado como sustrato, midiendo en distintas oportunidades, la absorbancia de la solución quecontiene la reacción, a medida que transcurre el proceso enzimático. Dado que la absorbancia es directamente proporcional a la concentración del producto generado, se logró determinar la velocidad inicial promedio de la reacción, en términos de abs min-1, llegando a que, a una temperatura de 25ºC, se obtuvo una velocidad promedio de 0,036 abs min-1, mientras que a una temperatura de 37ºC, unavelocidad promedio de 0,050 abs min-1, concluyendo que a mayor temperatura, mayor es la velocidad de reacción. Sin embargo, la fase de equilibrio en las dos hipérbolas que representan esta situación, no coinciden, lo que demuestra la existencia de errores sistemáticos, debido a la poca experiencia práctica que tenemos en el manejo de la instrumentación. Esta carencia y la no coincidencia del estado deequilibrio se ven reflejadas, además, al comparar a nivel de curso, el mismo experimento.















II. Introducción
La β-galactosidasa, es una enzima que obtiene, como productos, monosacáridos a partir de β-galactósidos, que, mediante hidrólisis, permite la ruptura de enlaces o-glucosídicos, interacción que une la galactosa con otro residuo orgánico.Estructuralmente, la β-galactosidasa es una proteína tetramérica, compuesta por 1023 aminoácidos, con una masa aproximada de 460 kDa, equivalente a 7,636 x10-19 g. El sitio activado de la β-galactosidasa, ubicado en el tercer dominio de los 5 que posee, hidroliza al enlace o-glicosídico del sustrato, en presencia de Na+ o Mg+2 en solución acuosa, de tal manera que el enlace es clivado por un grupocarboxilo terminal de un ácido glutámico (Glu) presente en la enzima (1). Entre las aplicaciones de la β-galactosidasa, se encuentra los procedimientos biotecnológicos utilizados en la industria láctea, cuyo interés, es la eliminación de la lactosa en la leche, obteniendo galactosa y glucosa como productos, para aquellas personas que no la metabolizan adecuadamente; como también, la producción degalacto-oligosacaridos con el fin de obtener alimentos lácteos prebióticos (2). Por otro lado, en el campo de la biología molecular, la β-galactosidasa es utilizado como un marcador, que permite monitorear la expresión genética, mediante el gen lacZ, en la técnica del ADN recombinante (3).
Cuantitativamente, la actividad enzimática de la β-galactosidasa, y así como la de cualquier enzima, puedeser medida comparando la concentración de productos generados con respecto al tiempo que transcurre la reacción. Con este propósito, se puede obtener indirectamente, la concentración de un determinado producto, midiendo en cada cierto rango de tiempo y con el uso de un espectrofotómetro, la absorbancia, magnitud que compara las intensidades de luz, de una longitud de onda específica, entrante ysaliente, que atraviesan un cierto medio.
Aplicando la ley de Beer-Lambert, para fases liquidas:
ecuación (1)
Donde l es el paso óptico o longitud atravesada por la luz en el medio, c la concentración de un determinado compuesto de la solución, es el coeficiente de absortividad molar, propia de la sustancia, y A la absorbancia medida en el...