Inmunologia

Inmunología III
Inmunoensayos.
Clasificación

Definición
» Método analítico basado en la reacción
antígenoantígeno- anticuerpo
» Hay muchos formatos , buscando
diferentes características de
funcionamiento.

¿Qué es un inmunoensayo?
• Puede ser cualitativo (identificación), semicuantitativo o
cuantitativo.
• Encuentran aplicación en muchos campos, no sólo en el
área clínica:ambiental, alimentaria, agronómica, etc.

Antígenos

• Sustancias que pueden ser reconocida por reacción con
ella de anticuerpos.
• Estructuras químicas muy diferentes: proteínas, lípidos,
polisacáridos, ácidos nucleicos, etc.
• Cada antígeno suele presentar varios determinantes
antigénicos o epitopos.

Antígenos
• Nativos.
• Se obtienen directamente a partir del patógeno. Ej. unaproteína purificada
• Recombinantes
• Péptidos sintéticos

Anticuerpos policlonales
• La inmunización de animales inyectando antígeno
• por la vía adecuada,
• en dosis adecuadas y
• en el adyuvante adecuado, (inmunógeno)

• producción de anticuerpos con diferentes afinidades y
con especificidad por diferentes determinantes
antigénicos (anticuerpos policlonales).

Anticuerpos policlonalesConejo, cabra, oveja, etc.
Purificación
de
anticuerpos
Separar el
suero

Anticuerpos monoclonales
• Se obtienen inmortalizando plasmocitos por fusión con
células de mieloma de ratón.
• Las células fusionadas (hibridomas) producirán
inmunoglobulinas idénticas a las que producía el
plasmocito.
• Por dilución límite se puede aislar(clonar) cada
hibridoma, mantenerlo y expandirlo encultivo.

Anticuerpos monoclonales

Plasmocitos
murinos

Fusión

Células de mieloma

hibridomas

Anticuerpos monoclonales

Cultivo de células individuales en pequeño volumen
Producción de Ac
Crecimiento continuo

-

+

-

+

-

+

+

-

Anticuerpos monoclonales

Cultivo en grandes
volúmenes

Recuperar y purificar el
AcMo secretado

Anticuerposmonoclonales
• Ventajas con respecto a los
policlonales:
• Alta especificidad,
reconocen un único
epitopo
• Se pueden obtener en
cantidades ilimitadas con
las mismas características.

• Desventajas:
• Mayor costo

Ejemplos

• Cualitativo o de identificación:

inmunoblot

• Cuantitativo: ELISA
• Inmunoblot
• Ejemplo: Supongamos que queremos saber si están
presentes en un suero losanticuerpos que reconocen la
banda de PM = 30 kDal del antígeno de Toxoplasma
gondii.

kDa

94

SDS-PAGE

43
30
14.4

Dirección de la
electroforesis

log PM

Rf

Transferencia

nitrocelulosa

Incubación con el suero problema

Conjugado enzimático

Sustrato

Producto
insoluble

Ejemplos:
• Etapas principales:
• separación por electroforesis según pesosmoleculares (SDS-PAGE),
• transferencia a membrana de nitrocelulosa ,
incubación con suero problema,
• incubación del conjugado (por ejemplo
enzimático),
• revelado y
• examen contra patrón de pesos moleculares.

Clasificación de inmunoensayos
• Caótica en general, variados criterios de clasificación
•
•
•
•
•

a) diseño competitivo o no competitivo
b) homogéneos y heterogéneos
c)por el método de detección
d) con o sin marcado
e) por el tipo de marca

Según el diseño del ensayo

De reactivo limitado o competitivos
(inmunoensayos propiamente dichos)

De reactivo en exceso o no
competitivos (ensayos
inmunométricos)

• Competitivos:
• Inmunoensayos en que se utiliza el marcado de antígeno
o anticuerpo.
• Una cantidad limitada de anticuerpos que esinsuficiente
para unir todo el antígeno.
• El antígeno marcado compite con el antígeno sin marcar
por los anticuerpos. La cantidad de analito se determina
a partir de la regresión correspondiente.

Competitivo- Captura de anticuerpos
E

Ac marcado

E

+

E

Ag muestra

Sustrato

Ag muestra
+
Ac marcado

Señal

[Ag]
Ag]

Señal

Competitivo- Captura de antígeno
Señal...