laboratorio de microbiología

MICROBIOLOGÍA AMBIENTAL

GUÍA DE PRÁCTICAS DE LABORATORIO

PRACTICA 4
Frotis fijos y coloreados - Técnicas de tinción

Estudio de la morfología de los microorganismos
Para estudiar la morfología de los microbios, forma, tamaño y agrupación es necesario utilizar técnicas
microscópicas. A pesar de los grandes desarrollos tecnológicos de los últimos años, la microscopía
sigue siendo lametodología de elección. Para ello la morfología microbiana se puede examinar de dos
maneras. Primero observando las preparaciones sin colorear (preparaciones en fresco, por ejemplo
para observar protozoos y microalgas) o con la ayuda de extensiones delgadas llamadas frotis que se
fijan y colorean.
El objetivo de esta práctica, que se realizará en dos sesiones, es el de conocer los principiosbásicos
para aprender a realizar frotis, a partir de diferentes tipos de muestras, a fijar y a colorear para estudiar
la morfología de las bacterias, los mismos principios básicos son aplicables cuando trate de estudiar la
morfología de otros grupos microbianos.
El objeto de la fijación es coagular el protoplasma preservando la morfología, adicionalmente permite
la adhesión de la muestra en elportaobjetos. El de la coloración es hacer los microorganismos y sus
estructuras visibles. Como agentes de fijación se pueden utilizar el calor, el alcohol y varios compuestos químicos. El más empleado para las tinciones bacterianas es el calor.

Tipos de tinción
• Tinción simple: Se lleva a cabo con colorantes básicos como el azul de metileno y el cristal violeta;
y colorantes ácidos como lanigrosina.
• Tinción diferencial: Como la coloración de Gram y la coloración de ácido alcohol resistencia útil
para el bacilo de la tuberculosis.
• Tinción de estructuras: Como las tinciones de Feulgen para colorear material genético y la de
Schaeffer Fulton para endosporas. También hay métodos especiales para colorear la pared celular,
los flagelos y las cápsulas.
• Tinción de materialde reserva: Ejemplos son las tinciones de Albert o de glucógeno y la de lípidos.

Coloración de Gram
A diferencia de las coloraciones simples, en esta se usa más de un colorante y las células bacterianas
se tiñen de acuerdo a su composición bioquímica. El procedimiento desarrollado por el bacteriólogo
danés Christian Gram, en 1884 permite además de estudiar la morfología celular bacteriana,clasificar
las bacterias en dos grandes grupos, las Gram positivas que retienen el colorante primario y las Gram
negativas que no lo hacen.
Las diferencias encontradas se basan en las diferencias entre las paredes celulares (figura 4) de las
bacterias. Las paredes de las Gram positivas poseen una gruesa capa de péptidoglucano, además de
dos clases de ácidos teicóicos, en tanto que en las Gramnegativas esa capa es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática exterior (de composición distinta a la interna) por medio
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INGENIERÍA AMBIENTAL

de lipoproteínas. Esta membrana exterior de las Gram negativas es rica en lípidos lo que aumenta su
susceptibilidad a solventes orgánicos, como la mezcla alcohol/acetona además, la capa depeptidoglucano que posee es demasiado delgada como para retener el complejo de cristal violeta/yodo formado
durante la tinción, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violeta. Por
el contrario, las bacterias Gram positivas poseedoras de una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del alcohol/acetona que másbien
deshidrata los poros de la pared cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal
violeta/yodo, y manteniendo la coloración violeta.
Hay varios factores que afectan la reacción de Gram, especialmente la edad de la bacteria, el uso de
algunos antibióticos y errores técnicos relacionados con preparación inadecuada de reactivos y fallas
en los tiempos de coloración....