Licenciado

MEMORIA DE
PRÁCTICAS
DE
TAB


4º Curso de LCA

BLOQUE I
PRACTICA 1: Subfraccionamiento celular de Saccharomyces cerevisiae.

Objetivos.
En esta práctica vamos a obtener una fracción de mitocondrias de levaduras, se hará mediante
una purificación de mitocondrias, que se trata de una serie de procesos que permiten aislar sólo a
las mitocondrias de una mezcla compleja. La purificaciónse llevará a cabo através de la rotura de
las células y un proceso de centrifugación diferencial hasta obtener la fracción de mitocondrias.
Además se guardaran muestras de otras fracciones obtenidas durante el subfraccionamiento para
su uso en prácticas posteriores.
Métodos y resultados:
En el proceso de purificación vamos a llevar a cabo un tratamiento químico y enzimático a través
de lossiguientes pasos, hasta que finalmente nos quedemos con las mitocondrias:
A. Digestión de la pared celular y lisis osmótica.
Empezaremos por el tratamiento químico, en este proceso romperemos los puentes disulfuro de la
pared celular utilizando DTT y el tampón de pretratamiento (tampón A), que sirve para mantener la
pared en un estado reducido para que una vez separados los puentes disulfurosno se vuelva a
juntar.
Una vez separados los puentes disulfuro, vamos a romper la pared celular mediante la Zymoliasa
que esta disuelta en tampón de digestión (tampón B), que sirve para mantener un estado
isosmótico y así la membrana no estalle y se liberen las proteasas que digieren todos los orgánulos
incluido las mitocondrias.
Una vez pasado un tiempo, vamos a romper la membrana porosmosis, para ello utilizaremos el
tampón de rotura (tampón C) que al añadirlo se da una diferencia de concentración en la célula
estallando, además añadimos PMSF que es un inhibidor de proteasas para que una vez rota la
membrana las proteasas no eliminen las mitocondrias. Para ayudar a la rotura utilizaremos un
homogenizador Dounce vidrio-vidrio y tras unos pocos golpes terminamos de romper lascélulas.
B. Purificación de mitocondrias.
Este paso lo llevaremos a cabo por medio de la centrifugación diferencial para obtener la fracción
de mitocondrias.
La centrifugación diferencial se basa en la existencia de diferentes partículas en la suspensión que
difieren en su densidad de la del medio. Si se centrifuga en condiciones suaves (poco tiempo, poco
fuerza de aceleración) sedimentarán laspartículas mayores y/o más densas. Cuando el
sobrenadante de la primera centrifugación es centrifugado de nuevo en condiciones de más tiempo
y más fuerza de aceleración sedimentan de nuevo las partículas más densas presentes, y así
sucesivamente. Se pueden aplicar condiciones crecientes de severidad en la centrifugación y
obtener una colección de sedimentos que corresponden sucesivamente afracciones de partículas
de diferente tamaño y/o densidad.
En el total de centrifugaciones lo que nos interesa es la fracción de mitocondrias, pero vamos a
guardar muestras de H, C y M para usarlas en la práctica 2, siendo H el sobrenadante de la
primera centrifugación que esta libre de núcleos y células no rotas, C es el citoplasma libre de
mitocondrias y M es la fracción de mitocondrias.PRÁCTICA 2: Utilización de marcadores enzimáticos en procesos de purificación.
Objetivos:
En esta práctica vamos a comprobar que el subfraccionamiento de la practica 1 sea correcto, para
ello vamos a determinar marcadores enzimáticos específicos para cada una de las fracciones que
en la practica 1 se guardaron (H, C y M), con esto vamos a comprobar el grado de pureza y
contaminación de lafracción mitocondrial (M). Para ello lo primero que haremos es determinar la
concentración de cada una de las muestras.
Las actividades enzimáticas a analizar son:
1-

NADH-citocromo c oxidoreductasa, (complejos I-III de la cadena mitocondrial). Se utilizara
como marcador de mitocondria.

Esta primera actividad ocurrirá entre los complejos I-III, en primer lugar le añadimos el NADH para...