ligacion

Ligaciones

En Biología Molecular es muy común realizar clonado de fragmentos de DNA en plásmidos comerciales. Para tal fin, una vez otenido el segmento de DNA que uno desea amplificar (con el finde realizar estudios posteriores), uno puede ligarlo a una mólécula plasmídica autorreplicante con la intención de multiplicarlo. Para realizar esto uno tiene que “ligar” ambas moléculas de maneratal de generar una construcción híbrida que aún conserve la capacidad autorreplicativa en E. coli. y que posea insertada la secuencia deseada.
La maquinaria replicativa de los seres vivos se compone devarias enzimas, entre las que encontramos la DNA ligasa. La misma cataliza la formación de enlaces fosfodiéster entre dsDNAs con un OH 3´ y otro con un fosfato 5´ (ambas moléculas con extremoscohesivos o en su defecto ambas con extremos romos). De acuerdo a la enzima que se utilice, la reacción tiene diferentes requerimientos. La DNA ligasa de E. Coli presenta actividad en presencia de -NAD,mientras que la DNA ligasa de fago T4 lo hace en presencia de ATP.
La definición de unidad enzimática aparece en general, como la cantidad de enzima requerida para generar el 50% de ligación de un DNAde fago  digerido con Hind III en 30 minutos a 16C en un volumen final de 20l conteniendo una concentración 0,12 M de 5´terminal.
Un protocolo posible de ligación sería de la siguiente manera:Vector de clonado (10 ng/l)
1 l
DNA a insertar ( N ng/l)
x l (ver fórmula)
Buffer ligasa (10X o 5X)
Vf/10 l o Vf/5 l
Ligasa T4
1U (1U/l)
H20
Vf – (Vf/10 l o Vf/5 l + x l + 1 l)Vf
Vf
De acuerdo a la siguiente fórmula para calcular las masas a introducir...

ng inserto = (R x ng plásmido x pb inserto)/ pb plásmido

...donde R es la relación molar entre plásmidoe inserto, siendo su valor dependiente del tamaño de las moléculas implicadas y de la calidad y compatibilidad de sus extremos.
La mezcla de reacción se incuba a la temperatura recomendada por la...