Marcadores moleculares de ADN






Marcadores Moleculares de ADN

REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA O PCR E INTRODUCCIÓN AL MEJORAMIENTO VEGETAL ASISTIDO
La base teórica de la reacción en cadenas de la polimerasa o PCR fue expuesta en 1971 (Kleppl et al.), pero esta técnica no produjo demasiado interés hasta mediados de los años 80
La tecnología denominada Reacción en Cadena de la Polimerasa o PCR (PolymeraseChain Reaction) fue desarrollada por Mullis y colaboradores a mediados de la década del ochenta (Saiki et al., 1985; Mullis y Falcona, 1987). El impacto causado en la ciencia por esta tecnología fue tan grande que le valió el premio Novel de medicina a Kary Mullis en 1993.
La técnica esta basada en la replicación in vitro del ADN, e imita el proceso natural que ocurre en todas las células vivas.Una célula para poder replicar su ADN requiere, entre otras cosas, de enzimas que desenrollen la estructura de hélice y separen las cadenas del ADN, una secuencia molde de ADN o templado de simple cadena a copiar, y enzimas que catalicen la unión de los nucleótidos a este último.
Para poder imitar este proceso, la técnica de PCR aprovecha las propiedades de desnaturalización y renaturalización delADN y provoca, en forma artificial, un aumento y descenso alternado de la temperatura (ciclos) del cóctel de reacción (premix), por medio de un ciclador térmico o termociclador.
En el cóctel de reacción o premix, se encuentran todos los elementos necesarios para la replicación: ADN, oligonucleótidos cebadores o "primers", una ADN polimerasa y nucleótidos (dNTPs).
En la primer parte del ciclo, elaumento de la temperatura hasta 95 °C, produce la desnaturalización del ADN, es decir la separación de las dos hebras de la doble hélice.
En la segunda parte del ciclo comienza a descender la temperatura, lo que permite la unión de las cadenas de simple hebra a los oligonucléotidos (10 a 30 bases) denominadas primers, que actúan como cebadores para el inicio de la replicación. La temperatura enla que se produce la unión del primer a la cadena molde de ADN se conoce como temperatura de annealing, y depende del largo, de la composición de bases del primer y oscila entre los 50 y 60 °C. Esta temperatura es mayor que la que permite la unión de las hebras de ADN separadas (45°C), por lo que el primer se hibrida antes con la cadena molde durante el descenso de temperatura.
A diferencia de lareplicación de ADN celular, en la que los cebadores reconocidos por la ADN polimerasa son secuencias de ARN, los cebadores utilizados en la reacción de PCR son secuencias de ADN.
En la reacción de PCR, los primers (sintéticos) tienen una secuencia que les permite hibridar, en forma específica, y amplificar la secuencia compredida entre dos primers con la secuencia blanco que el usuario quiereamplificar.
Una vez que se produce la hibridación de los primers, la enzima ADN polimerasa cataliza la síntesis de una nueva hebra de ADN, incorporando a la cadena en formación, a través de uniones fosfodiester, los nucleótidos con las bases complementarias a la cadena molde.
La enzima responsable de la replicación en las células es la ADN polimerasa. Esta cataliza la unión del grupo OH-3' delextremo del cebador, con el grupo fosfato del deoxiribonucíeósido trifosfato que se incorpora a la cadena en síntesis a través de una unión fosfodiester.
En la célula la replicación ocurren a temperatura constante e intervienen distintas enzimas que catalizan todas las reacciones y que son sensibles al aumento de la temperatura ya que, como son proteínas, se desnaturalizan y pierden suspropiedades a los 45°C.
En al reacción de PCR estos procesos ocurren en un tubo de ensayo sometido a variaciones de temperatura con un máximo de 95 °C, y la polimerización es conducida por una ADN polimerasa llamada Taq polimerasa obtenida de bacterias termófilas (Thermus aquaticus). Esta enzima tiene su temperatura óptima de catalización a 72 °C.
En la utilización de esta enzima se basó el gran...