Metodología Y Aplicaciones De La Amplificación De Material Genético

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Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular

Práctica 3 Metodología y aplicaciones de la amplificación de material genético: Introducción a la bioinformática. Curso 1 Medicina (Abril) 2012 BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR HUMANA
Mohammed Rafii-El-Idrissi Benhnia Ph.D. Phone: 954559852 Email: rafiim@us.es

Departamento de Bioquímica Médica y Biología MolecularOBJETIVOS
1.  Familiarizarse con el proceso de amplificación mediante polimerasas 2.  Identificar los parámetros críticos de una PCR y familiarizarse con el fundamento de la electroforesis de ácidos nucleicos 3.  Secuenciación de ADN. 4.  Identificar en el laboratorio virtual una especie patógena mediante PCR 5.  Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RTPCR) 6.  Caso práctico: usode las bases de datos de genes (BLAST) y familiarizarse con la notación

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Departamento de Bioquímica Médica y Biología Molecular

OBJETIVOS
1.  Familiarizarse con el proceso de amplificación mediante polimerasas 2.  Identificar los parámetros críticos de una PCR y familiarizarse con el fundamento de la electroforesis de ácidos nucleicos 3.  Secuenciación de ADN. 4.  Identificaren el laboratorio virtual una especie patógena mediante PCR 5.  Retrotranscripción-amplificación en cadena de la polimerasa (RTPCR) 6.  Caso práctico: uso de las bases de datos de genes (BLAST) y familiarizarse con la notación

¿Qué es la PCR?
•  PCR: Reacción en cadena de la polimerasa (Polymerase Chain Reaction, Kary Mullis-1985) •  Amplificación selectiva de un segmento particular de ADN • El segmento puede representar una parte pequeña de entre una mezcla heterogénea de AND: e.g. un exón específico de un gen humano

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¿Qué es la PCR?
•  Herramienta muy poderosa de amplificar y/o detección de fragmentos de ADN de interés ~2 horas. •  La técnica de la PCR tiene multitud de aplicaciones: Ø  Diagnóstico (prenatal, infecciones microbianas, mutaciones de oncogenes,…etc) Ø Medicina forense Ø Antropología o Arqueología molecular Ø Microbiología ambiental

¿Qué hay en la reacción?
•  Molde de ADN •  Tampón or “buffer” de la reacción – mantener pH adecuado para el funcionamiento de ADN polimerasa (Tris, iones amonio, iones magnesio, albúmina bovina sérica) •  4 nucleótidos trifosfato (dNTPs): dATP, dCTP, dTTP y dGTP •  Cebadores (primers) •  ADN polimerasa(normalmente Taq)

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¿Qué hay en la reacción?
Reagent for PCR Taq DNA polymerase (added last) 10x buffer dNTPs (10 mM each, combined) Forward primer Reverse primer dH2O (nuclease free) Template (AND) Volume (µl) for each (25 µl total) 0.25 2.5 0.5 0.5 0.5 19.75 or 19.25 1 Final concentration 50 U/ml 1x 200 µM 1.2 µM 1.2 µM

¿Qué hay en la reacción?
CONTROLES EN LA REACCIÓN DEPCR
CONTROL NEGATIVO + TaqPol, dNTPs, buffer, cebadores CONTROL POSITIVO + TaqPol, dNTPs, buffer, cebadores MUESTRA PROBLEMA + TaqPol, dNTPs, buffer, cebadores

H 2O
DNA conocido

FALSOS POSITIVOS

CONTROL DE LA AMPLIFICACIÓN DIAGNÓSTICO

DNA SEGURO desconocido

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Termocicladores
•  Gran variedad de suministradores. •  Gran variedad de formatos. •  Reacciones se llevan acabo en tubos o en placas de 96.

Cebadores
•  Oligonucleótidos deben tener ~20 bases. •  El contenido G/C debe ser del 45–55%. •  La base en el extremo 3´ debe ser G o C. •  Los cebadores no deben ser complementarios entre ellos o formar bucles consigo mismo.

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Cebadores
Cebadores que forman bucles
•  5´-GTTGACTTGATA ||||| T 3´-GAACTCT

Cebadores
•  Un cebador puedeformar un dímero consigo mismo o con otro cebador.
5´-ACCGGTAGCCACGAATTCGT-3´ |||||||||| 3´-TGCTTAAGCACCGATGGCCA-5´

•  Los cebadores pueden ser excelentes, pero no deseados, substratos para la Taq polimerasa.

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Etapas de un ciclo de PCR
1- Desnaturalización “denaturation” 95°C, 30 sec. 2- Alineamiento “Annealing” 55–60°C, 30 sec. 3- Extensión “extension/elongation” 72°C, 45...