metodos enzimaticos

DETERMINACIN DE GLUCOSA POR MTODOS CUALITATIVOS Y CUANTITATIVOS 1. Aspectos tericos. En estado de post-absorcin la concentracin de glucosa sangunea en el hombre vara entre 70 -110 mg/100mL. La mantencin de valores estables de glucosa en la sangre es uno de los mecanismos ms finamente regulado. En esta regulacin participan el hgado y varias hormonas. Cuando la glucosa sangunea alcanza valoresrelativamente altos, el rin tambin ejerce un efecto regulador. La glucosa filtrada continuamente por los glomrulos es habitualmente reintegrada por completo a la sangre por el sistema de resorcin de los tbulos renales. La resorcin de glucosa est enlazada con el aprovisionamiento de ATP en las clulas tubulares. La capacidad del sistema tubular para absorber glucosa est limitada a una tasa aproximadade 350 mg/min. Cuando la cantidad de glucosa en la sangre sobrepasa la que puede ser reabsorbida el exceso pasa a la orina producindose glucosuria. En los individuos normales la glucosuria ocurre cuando la concentracin de glucosa en la sangre venosa es superior a 170 180 mg/100 mL. glucosanormal en sangre 70 110 mg/dL ( 3,9 6,1 mmol/L). glucosanormal en orina 1 15 mg/dL ( 0,06 0,8mmol/L). Mtodo cualitativo tiras colorimtricas. La glucosa puede ensayarse cualitativamente con el uso de tiras colorimtricas. Este test usa glucosa oxidasa que cataliza la oxidacin de D-glucosa a cido glucnico con formacin de H2O2. En presencia de loa enzima peroxidasa, el H2O2 generado oxida un cromgeno (orto-dianicidina), produciendo un cambio de color, que indica la presencia de glucosa.Este mtodo es especifico para la glucosa y la detecta cuando su concentracin est sobre el rango normal. Mtodos cuantitativos. Mtodo qumico o-toluidina. La o-toluidina se condensa inicialmente con el grupo aldehdo de la glucosa para formar una mezcla en equilibrio de la glucosilamina y la base de Schiff correspondiente. Las reacciones que tienen lugar despus de la condensacin original producen unamezcla de cromgenos verdes con una longitud de onda analtica a 630 nm. Mtodo enzimtico Trinder 100 (Sigma). El mtodo enzimtico se basa en la especificidad de la enzima glucosa oxidasa (GOD) por la (-D-glucosa. La enzima cataliza la oxidacin de la glucosa por oxgeno molecular dando el D-gluconato y perxido de hidrgeno (H2O2, agua oxigenada) (Rxn. 3.1). Para detectar y cuantificar esta oxidacinse ocupa una reaccin acoplada (Rxn. 3.2). En forma cuantitativa el H2O2 es oxidado por un reactivo comercial (4-aminofenazona (4-AF) y 4-hidroxibenzoato), reaccin catalizada por la enzima peroxidasa, para dar como producto un compuesto coloreado rojo (quinonimina) que se cuantifica midiendo la absorbancia a 505 nm. EMBED Equation.3 Reaccin 3.1 EMBED Equation.3 Reaccin 3.2 Objetivos.Detectar glucosa en una muestra biolgica mediante tiras colorimtricas. Cuantificar glucosa en una muestra mediante un mtodo qumico (o-toluidina) y un mtodo enzimtico (Trinder-100). Parte experimental. Materiales espectrofotmetro/ celdas trpode/ rejilla / mechero bao termostatizado cronmetro 15 tubos de ensayo 2 gradillas 2 pipetas graduadas de 1 mL 1 pipeta graduada de 5mL 1pipeta graduada de 2 mL 1 pizeta 1 matraz de aforo de 100 mL 1 vaso precipitado de 250 mL 1 vaso precipitado de 500 mL termmetro Remueva inmediatamente el exceso de muestra de la tira. Espere 10 minutos exactos para el desarrollo del color. Compare el color de la tira con la escala de colores que indica el nivel de glucosa. Descarte cambios de colores despus del tiempo indicado. 4.2Mtodo de la o-toluidina De acuerdo a la tabla 3.1 Prepare una batera de tubos rotulados. Agregue el volumen indicado de la solucin estndar de glucosa (16 mg/dL) a los tubos 2S 6S. Agregue 0,5 ml de las diferentes muestras problemas a los tubos 7MP 9MP. Complete el volumen de los tubos a 0,5 mL agregando el volumen indicado de agua destilada. Agregue 3,0 mL de la o-toluidina con una pipeta...