metodos inmunologicos

ELISA
(Inmunoanálisis ligado a enzimas)
Técnica basada en la capacidad de un anticuerpo determinado de
reconocer y unirse a un antígeno que ha sido adsorbido a un pocillo
de una placa demicrotitulación.

ETAPAS EN EL ENSAYO DE ELISA
- Se agrega el antígeno a estudiar a los pocillos de la placa el que se
adsorbe a las paredes.
- Se bloquean todos los sitios de la pared del pocilloque no están
unidos a antígeno con una proteína (albúmina de bovino).
- Se agrega el anticuerpo específico para que se una al antígeno.
Habitualmente es de tipo IgG.
- Se agrega el segundoanticuerpo. Este anticuerpo es anti IgG y está
unido a una enzima (fosfatasa alcalina; peroxidasa).
- Se agrega una solución con un sustrato específico para la enzima,
generándose un producto coloreadocuya intensidad es medida con un
espectrofotómetro. La intensidad del color es proporcional a la
cantidad de complejo antígeno-anticuerpo.
Usos: identificación y cuantificación de antígenosproteicos.
Ventaja: posibilidad de analizar simultáneamente muchas muestras.

ELISA

WESTERN BLOT
Muy usado en la detección de una proteína en una mezcla impura.
Proporciona la siguiente información:Cualitativa: ¿está presente la proteína?
Cuantitativa: ¿qué cantidad de la proteína hay en la muestra?
Estructural: ¿qué tamaño tiene la proteína?
Protocolo:
- Se separa una mezcla de proteínaspor electroforesis desnaturante.
- Se transfieren las proteínas a una membrana (nitrocelulosa)
- Se bloquea las áreas de la membrana no ocupadas con una proteína
inespecífica (albúmina de bovino).- Se aplica a la membrana un anticuerpo primario específico contra la
proteína en estudio.
- Se incuba la membrana con un anticuerpo secundario de gran afinidad
al anticuerpo primario, unido a unaenzima (similar a ELISA).
- Usando un sustrato que genera un producto coloreado se detecta la
presencia de la proteína en estudio.

Transferencia manual de proteína o ácido nucleico de un gel...