Microbiología

TRABAJO PRÁCTICO Nº 1

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PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS: FRACCIONAMIENTO SALINO Y CROMATOGRAFÍA POR TAMICES MOLECULARES

Aislamiento de albúmina de huevo

La clara de huevo es esencialmente una solución de proteínas que contiene una pequeña cantidad de sales y azúcar. La proteína más abundante es la ovoalbúmina (54%) y le siguen en cantidad laconalbúmina (13 %), ovomucoide (11 %), lisozima (3.5 %), ovomucina (1.5 %) y otras fracciones menores que el 1 %.
Solubilidad de las proteínas

Las albúminas se diferencian de las globulinas, de las cuales van frecuentemente acompañadas, por su solubilidad en agua destilada y su comportamiento frente a las sales.
Globulinas: son insolubles en agua. Precipitan con una pequeña concentraciónsalina, encontrándose totalmente precipitadas con (NH4)2SO4 ó Na2SO4 al 50 % de saturación.
Albúminas: son solubles en agua. Precipitan recién con concentraciones de (NH4)2SO4 ó Na2SO4 superiores al 50 %.
A) Fraccionamiento salino

Reactivos: Solución 100 % saturada de (NH4)2SO4; Solución de BaCl 2 5 %; Reactivo de biuret.
Técnica: Se mide el volumen de una clara de huevo y se agrega un volumenigual de solución saturada de (NH4)2SO4. El agregado debe ser lento, con agitación continua. Se deja reposar 10 minutos y luego se centrifugan las globulinas (15 minutos a 3500 rpm). En el sobrenadante queda la albúmina que se pasará a través de una columna de Sephadex G-25 para su desalado. Previo a la siembra se disuelven blue dextran y CoCl2 sólidos en el volumen de muestra a cromatografiar paradeterminar el Vo y el Vt.
B) Filtración por gel

Desalado: El sobrenadante que contiene ovoalbúmina, obtenido después de la precipitación de las globulinas con (NH4)2SO4, se hace pasar a través de una columna de Sephadex G-25 para eliminar los iones salinos.
1) Preparación de la columna
El Sephadex G-25 se provee ya hidratado. La suspensión del gel hidratado debe tener una consistencialigeramente espesa. No debe ser demasiado espesa porque eso favorece la retención de burbujas de aire y las mismas producen discontinuidades en la columna que afectarán la separación.
Instalar la bureta que se usará como columna en un soporte adecuado y colocar un taponcito flojo de lana de vidrio en el fondo, para evitar que se escape el material de relleno. Resuspender el gel removiendosuavemente con una varilla y llenar la bureta casi por completo con esta suspensión, echándola por la pared interna de la columna. Es conveniente que todo el gel requerido para la preparación de la columna sea vertido en una sola operación, de esa manera se logrará un relleno parejo y sin fracturas. Dejar decantar el gel. Cuando la columna tenga aspecto compacto (el volumen de lecho conveniente para estaseparación es de 12- 15 ml) abrir la llave de la bureta y dejar fluir el líquido con el cual se equilibra (agua destilada) hasta que quede aproximadamente 1 ml de agua por encima del gel. NO DEJAR SECAR LA COLUMNA en ninguna etapa de la operación puesto que eso produce discontinuidades en el relleno.
2) Separación
Se siembra el sobrenadante que contiene ovoalbúmina y (NH4)2SO4 (sembrar nomás de 3 ml) con cuidado, por la pared interna de la bureta para no descompactar el relleno. Se abre la llave dejando entrar la muestra. Una vez que la muestra ha entrado a la columna se comienzan a recoger fracciones de 2 ml y se agrega líquido de elución (agua destilada) por la parte superior de la misma. El líquido de elución debe cubrir siempre la columna. Se recogen 10 - 12 fracciones y secierra la llave. Sobre una alícuota de cada tubo se determinará cuantitativamente el contenido de proteínas por el método del biuret. El de (NH4)2SO4 se apreciará sobre otra alícuota con una gota de solución de BaCl 2, asignando valores arbitrarios proporcionales al precipitado obtenido. En un mismo gráfico se trazarán las curvas obtenidas en función del volumen recogido.
C) Dosaje de...