Microscopio confocal

Microscopía laser confocal

Problemas de la microscopía de fluorescencia de campo amplio

• La iluminación vertical hace que el especímen fluoresca en todo su grosor. Esto causa que, en lamayoría de los casos, más del 90% de la fluorescencia emitida esté fuera de foco. - la luz fuera de foco interfiere con los detalles que están en foco. - hay bajo contraste entre la señal y el ruido • Ladispersión, por el especímen, de la luz emitida hace parecer que la fluorescencia emitida proviene de un punto diferente.

¿Qué es un microscopio confocal? ¿Cómo soluciona estos problemas?

Lamicroscopía confocal es una herramienta poderosa que permite generar imágenes de alta resolución y permite realizar reconstrucciones 3D de un especímen. ¿Cómo lo logra? Eliminando la fluorescencia fuerade foco proveniente de otros planos del especimen y filtrando la luz dispersada. De esta forma puede generar imágenes nítidas que corresponden a planos definidos de la muestra.

¿Cómo funciona unmicroscopio confocal?
• Mediante el empleo de un laser se ilumina de un punto o región a la vez. Sin embargo, esto no remueve la luz fuera de foco ni la dispersada. • Mediante una apertura o pinhole,sólo se deja pasar al detector la luz emitida que está en foco y que proviene del punto iluminado. Región fuera de foco Región focal Región fuera de foco Objetivo Pinhole Detector

¿Cómo funciona unmicroscopio confocal? Campo amplio Lámpara Diafragma de Excitación

Confocal Láser Pinhole de Excitación Filtro de Excitación PMT

Ocular

Objetivo

Objetivo

Filtro de Emisión

Filtro deEmisión Pinhole de Emisión

¿Cómo funciona un microscopio confocal?

Zeiss LSM510 with 4 color capability

UV 351,364nM Argon 488nM HeNe I 543nM HeNe 2 633nM

¿Cómo funciona un microscopioconfocal?

• Para poder generar una imagen completa del plano el microscopio realiza un escaneo punto a punto en el plano X-Y moviendo la dirección del laser a los distintos puntos de la...