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Modelo de H+ATPasa de Neurospora crassa

Amarilla, L., Pafundo, D.E., Rotondo, E.F.


Introducción


Neurospora crassa es un hongo mesófilo que ha sido usado ampliamente en estudios de transporte de membrana. Uno de los principales aspectos de éstas membranas plasmáticas es la presencia de una bomba de protones dependiente de ATP que produce un flujo de salida de iones H+, generandoentonces potenciales de membrana de entre –200 y –250 mV (5). Esta bomba se encuentra acoplada a cotransportadores dependientes de H+, de glucosa y de aminoácidos (6).
El pH intracelular de estas células en condiciones fisiológicas es de 7.2 (4) y puede disminuir frente a diversos factores, como por ejemplo el aumento en el volumen celular (3) y cambios en el metabolismo (1).
El efecto de laH+ATPasa en la regulación del pH intracelular es discutido (4) aunque, dada su capacidad para la salida de H+ de la célula, se podría postular a esta bomba como uno de los posibles mecanismos de regulación del pH intracelular. Mediante estudios conformacionales se determinó que esta bomba contiene un dominio, llamado A en el modelo de Kühlbrandt et al. (2), que es postulado como un posible sensor delpH, otra función postulada para este dominio es la de ser un reservorio de protones, lo cual no sería consistente con una función regulatoria ya que siempre estaría bombeando protones al exterior y no tendría freno. En este trabajo se tomo en cuenta la función del dominio A como sensor de protones, dado que se considera a la bomba como un posible mecanismo regulador de pH.
En el presente trabajose propuso un modelo del funcionamiento de la H+ATPasa de Neurospora crassa, y un mecanismo de regulación mediado por concentraciones intracelulares de ATP, utilizando un modelo conformacional propuesto anteriormente (2).



Resultados y discusión


Modelo estudiado

La figura-1 (2) muestra el mecanismo de transporte y regulación de protones. La bomba H+ATPasa es activada por lafosforilación reversible del dominio R. Este dominio, cuando es defosforilado (en el estado inhibido), se une al dominio N impidiendo que el ATP pueda llegar al sitio de fosforilación. En el estado activado E1, el protón tiene acceso al sitio de ligadura del dominio M y aumenta la afinidad por el H+ en el mismo. Asimismo, el ATP tiene acceso en esta conformación al sitio de fosforilación.El protón ligado provoca un cambio conformacional que es transmitido, a través de M4 y M5, a los dominios A y P, que se reorientan. El movimiento del dominio A, empuja al M2 hasta una posición en la que inhibe la llegada de protones al sitio de ligadura en la membrana. La fosforilación del aminoácido Asp378 en el dominio P reduce la afinidad de los sitios de ligadura en lamembrana con los protones, que son liberados hacia el exterior. Luego, la enzima retorna al estado E1, previo paso por el E2, y comienza un nuevo ciclo de bombeo de iones.


Modelo propuesto

Se plantearon las siguientes reacciones:

Donde: ATP es la concentración intracelular del nucleótido; K, la concentración de enzima kinasa que cataliza la fosforilación de R; NI, el número de H+ATPasa enel estado inhibido; NE1, el número de H+ATPasa en el estado E1; ADP, la concentración del nucleótido intracelular; P1, la concentración de enzima fosfatasa que cataliza la defosforilación de R; A1 y A2, estados de transición de las reacciones de fosforilación y defosforilación de R, respectivamente; H+cit, la concentración de protones en el citoplasma; NE1H, el número de H+ATPasa en el estado E1con un protón unido; NE1P, el número de H+ATPasa en el estado E1H con una molécula de ATP en el sitio de fosforilación; NE2P, el número de H+ATPasa en el estado E2P; NE2, el número de H+ATPasa en el estado E2; H+out, la concentración de protones en el medio extracelular; kj y nj son las tasas de reacción y las constantes de inyección/ extracción, respectivamente.
Se modelaron las reacciones en...