molecular

Detección molecular de patógenos – Método rápido vía
amplificación isotérmica
Alejandro Rojas

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Métodos Rápidos
 Cualquier método destinado a la detección, recuento, caracterización
y subtipificación de microorganismos (patógenos y de deterioro)
mediante el cual se obtienen resultados de manera sencilla, fiable y
en menor tiempo que con los métodosconvencionales.
 El desarrollo de los métodos rápidos constituye un área de la
microbiología aplicada muy dinámica y en continua evolución.
 Innovaciones en biotecnología, biología molecular, micro-fabricación
y bio-informática han avanzado las técnicas de ácidos nucleícos de
posibilidades futuristas a técnicas comunes de laboratorio.

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Métodos Rápidos
¿Cuál es el mejor método rápido?
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Tipo de alimento producido por la empresa que lo va a implementar
Capacitación de los analistas
Decisión y costos
Cantidad de análisis diarios
Utilización de equipamiento adicional
Tiempo de obtención de resultados
Complejidad del análisis

Métodos genotípicos - detección de patógenos
Detección de bacterias patógenas en alimentos luego de
un paso deenriquecimiento
 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
– PCR convencional
– PCR en tiempo real

 Hibridización (rRNA) fluorescente – microscopia epiflorescente
 Biosensores – señal electroquímica
 Amplificación Isotérmica de ADN - LAMP

V. Jasson et al. Alternative microbial methods: An overview and selection criteria. 2010
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Amplificación Isotérmica de Ácidos Nucleícos
 La demanda deinstrumentos de menor costo y operación mas
sencilla, sin perdida de sensibilidad, ha resultado en una nueva
tecnología para amplificación de ADN: Amplificación Isotérmica.
 Derivada del concepto natural de duplicación del genoma en
organismos vivos, donde la duplicación de ADN/ARN ocurre sin
necesidad de ciclos de temperatura, o sea de manera isotérmica.
 Una de las grandes ventajas deeste tipo de amplificación esta
relacionado con la mayor tolerancia a inhibidores que acostumbran
interferir en la metodología PCR.

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Amplificación Isotérmica de Ácidos Nucleícos
 Amplificación Isotérmica se ha conocido desde hace casi dos
décadas pero no se había popularizado, probablemente por la
dificultad en diseñar primers específicos y en la optimización de la
reacción deamplificación.
 Varias técnicas de amplificación isotérmica se han desarrollado en
este tiempo sin necesidad de termociclador.
 Estos métodos muy diferentes a PCR, se basan en avances en
síntesis de ADN/ARN y de proteínas auxiliares que simulan con alta
fidelidad la amplificación de acido nucleíco in vitro.

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Amplificación Isotérmica de Ácidos Nucleícos
 Se han descrito diversos métodosde amplificación
isotérmica en la literatura científica, cada uno con
características propias.
 Las principales diferencias con la tradicional técnica de
PCR son:
– No es necesario un pre-tratamiento térmico para abrir la cadena
de ADN,
– El tipo de ADN polimerasa,
– El numero de primers o sondas utilizados en la reacción, y
– La forma de detección del producto de la reacción.
Gill &Ghaemi (2008) - Nuclei Acid Isothermal Amplification Technologies- A Review..
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Amplificación Isotérmica LAMP
 De los métodos de amplificación isotérmica cabe destacar el método
conocido como LAMP (loop-mediated isothermal amplification –
amplificación isotérmica mediada por un bucle).
 En la técnica LAMP la secuencia de ADN molde se amplifica siguiendo
estos parámetros:
– Temperaturaconstante (de 60° - 65°C)
– Acción de dos o tres conjuntos de primers
– Una polimerasa diferente de la Taq polimerasa que se usa en PCR.
(Aquí se usa la Bst polimerasa, producida por Bacillus stearothermophilus, que
además de la actividad de polimerización de los nucleótidos, tiene la capacidad
de abrir las cadenas dobles de ADN sin necesidad de calentamiento).

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Amplificación...