Obtención de la proteína X- EGFP a partir de células eucariotas y procariotas

Obtención de la proteína X- EGFP a partir de células eucariotas y procariotas

El objetivo del presente estudio es evaluar la producción a gran escala de la proteína humana X, cuya ausencia produce una patología.
Se propone la utilización de un vector versátil, que permita la expresión del gen de interés tanto en sistemas eucariotas como procariotas. Se utilizaron 2 sistemas de transfección.Para la purificación se utilizo el método IMAC y se comprobó la correcta expresión mediante SDS PAGE y Western Blot.
Se comprobó que este sistema es útil para la producción de la proteína X.

Introducción

Existen numerosas enfermedades (Alzheimer, Parkinson, Fibrosis quística) que son causadas por la ausencia parcial o total de ciertos genes, o por deleciones en los mismos. Esto produce laausencia o perdida de funcionalidad de proteínas importantes. Hoy en dia, gracias al avance en el manejo de la expresión y purificación de proteínas recombinantes, contamos con nuevas herramientas para su aplicación como terapia en este tipo de enfermedades.
El objetivo del presente estudio es evaluar la producción a gran escala de la proteína humana X, cuya ausencia produce una patología. Sepropone la utilización de un vector versátil de trabajo, que permita la expresión del gen de interes. Se trabajo en sistema eucariota; células CHO y procariota; células E. coli.
Tambien se evaluo la purificación de la proteína expresada. Como gen reportero se utilizo la proteína verde fluorescente (EGFP), elegida por su capacidad de emitir luz en la zona verde del espectro visible, con locual resulta sencillo evidenciar la efectividad de experimentos de transfección y/o purificación.
Luego de una búsqueda bibliográfica adecuada, se determino que un vector apropiado podría ser el pTriex2. El mismo puede utilizarse tanto en euca como en procariotas, y agrega un tag de histidina a la proteína.
Fueron evaluados 2 sistemas. Se ensayo la expresión de X-EGFP en células CHO (eucariotas)mediante dos métodos de transfeccion distintos: fosfato de calcio y lípidos catiónicos. Luego se utilizó una cepa de E.coli que expresaba EGFP y se realizó la purificación de la proteína reportera partir de un lisado utilizando una columna de afinidad (IMAC Inmobilized Metal ion Affinity Chromatography) valiéndonos de la etiqueta de histidina presente en la proteína recombinante. Por último,se constató la presencia de las proteínas por Western Blot. Este estudio revelo una transfección y transformación exitosa tanto en células eucariotas como en procariotas.


Materiales y Métodos

Transfección de células CHO con los plásmidos pTriEx2-EGFP y pTriEx2 utilizando fosfato de calcio y lípidos catiónicos.
24 horas antes de realizar la transfección se plaqueó una placa de24 pocillos con 10000 células por pocillo.
Antes de comenzar, se cambió el medio de las placas por medio fresco. Para esto se agregaron 500 µl de medio con 2% de SFB. Originalmente, cada pocillo tenía medio con 10% de SFB. La reducción de la concentración del mismo se realizó con el fin de tener menos proteínas en el medio, que podrían interferir con la transfección. Previo al agregado del mediofresco se lavó la placa con 500 µl de PBS.
Para realizar la transfección con fosfato de calcio se prepararon 2 tubos con dos condiciones diferentes de ADN: el primero con el plásmido pTriEx-EGFP y el segundo con el plásmido pTriEx2 (control). Para preparar los tubos se tuvo en cuenta lo siguiente: se transfectarían 2 pocillos por cada condición y se consideraría un 20% más al calcular losvolúmenes, por el error de pipeteo.
Para la transfeccion con lípidos cationicos utilizamos Gene Juice.

Fosfato de Calcio
Solucion 1 (2 tubos): 1ul ADN pTriEx-EGFP/1ul pTriEx (plasmido control)
Solucion 2 (2 tubos): 50ul HBSS
Nota: El stock de DNA es de 1 ug/ul

Lipidos cationicos
Solucion 1 (2 tubos): 50 ul medio F12 + 3 ul de gene juice
Solucion 2 (2 tubos): 50 ul de med F12 K+ 0.8ug...