Obtencion de preparados crudos enzimaticos

Obtención de preparados crudos enzimáticos y determinación cualitativa de la actividad enzimática
Introducción
La enorme variedad de reacciones químicas que comprende la vida está mediada casi en su totalidad por un conjunto de catalizadores biológicos notables, denominados enzimas. A pesar de que estas sustancias se encuentran gobernadas por las mismas leyes de la naturaleza que gobiernan lasdemás sustancias, difieren de los catalizadores químicos habituales en varios aspectos importantes como: incrementar las velocidades de reacción, no requieren de altas de temperaturas o de condiciones extremas para actuar, tienen un grado de especificidad alto con respecto de sus sustratos, su síntesis o acción está regulada por diversos mecanismos (como el control alostérico y la modificacióncovalente). 1
Al contrario de casi todos los catalizadores usados en la química sintética, las enzimas son específicas tanto para el tipo de reacción catalizada como para un sustrato único o un pequeño conjunto de sustratos estrechamente relacionados. Las enzimas también son catalizadores estereoespecíficos y de manera típica catalizan reacciones de un solo tipo de estereoisómero de un compuestodado. 2
Cuando se ha desnaturalizado una proteína o una enzima, se pierde la estructura nativa junto con muchas de sus propiedades específicas. La cadena desplegada es un ovillo aleatorio, con libertad de rotación alrededor de los enlaces tanto en el armazón polipeptídico como en las cadenas laterales. Ya no tiene una conformación compacta única, sino que fluctúa continuamente entre un gran númerode conformaciones extendidas. Por ejemplo, en el caso de la desnaturalización de la enzima ribonucleasa por aumento de la temperatura, se pierden sus estructuras secundaria y terciaria, no pudiendo actuar como catalizador para la fragmentación del RNA, sin embargo esta desorganización total de la estructura de la ribonucleasa es completamente reversible, ya que si esta vuelve a las condicionesfisiológicas normales de temperatura y disolvente, se plegará espontáneamente a su estructura nativa. 3
La mayoría de las reacciones catalizadas por enzimas pueden clasificarse en cuatro categorías: reacciones de oxidorreducción, son las más importantes para la extracción y transferencia de energía en las células debido a que se transfieren electrones o protones de una molécula a otra;reacciones de hidrólisis-deshidratación son importantes para la degradación y síntesis de biomoléculas grandes; reacciones de adición-eliminación-intercambio agrega un grupo funcional a uno o más de los sustratos, remueve un grupo funcional de los mismos sustratos y por último los grupos funcionales se intercambian entre los sustratos durante estas reacciones mientras que las reacciones de ligadurason aquellas que unen dos moléculas usando enzimas como sintetasas de la energía del ATP, un ejemplo de estas reacciones es la síntesis de acetil CoA a partir de ácidos grasos y de coenzima A. 4
La centrifugación es el primer paso en un esquema típico de purificación de proteínas. Se basa en el principio de que dos partículas en suspensión (células, orgánulos, moléculas), con masas y densidadesdistintas, sedimentarán en el fondo de un tubo a velocidades diferentes. Las proteínas presentan grandes variaciones en masa, pero no en densidad. A menos que una proteína esté adosada a un lípido o carbohidrato, su densidad no variará en más del 15% de 1.37 gcm-3, la densidad promedio de una proteína. Las moléculas más pesadas o más densas sedimentan con más rapidez que las livianas o menosdensas. La centrifugación se utiliza con dos fines principales: como técnica preparativa para separar un material del resto y como técnica analítica para medir propiedades físicas como el peso molecular, la densidad, forma y constate de disociación de macromoléculas. Finalmente la constante de sedimentación, S, de una proteína es una medida de la velocidad de sedimentación. La constante de...