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Hibridación in situ

http://www.bdigital.unal.edu.co/2666/1/780119.2010.pdf
La técnica de hibridación in situ está basada en la capacidad que poseen los ácidos nucleicos para hibridarse entre sí, es decir, la existencia de determinada secuencia de ADN o ARN, que resulta complementaria con otra secuencia.
Su utilidad reside en la capacidad de poder demostrar mediante la utilización de unasonda (formada por una secuencia de ADN previamente conocida) marcada con un isótopo radiactivo, la presencia de determinada secuencia de ADN o ARN complementaria, en la muestra a estudiar.
Lo que se produce mediante la utilización de esta técnica es: La hibridación (unión), de la sonda marcada, con la secuencia a buscar (en el caso de estar presente en la muestra) y posteriormente mediante técnicasespecíficas (autoradiografía o inmunohistoquímica), la transformación de la secuencia en algo visible.
Esta técnica es muy útil, por ejemplo, para identificar la secuencia de nucleótidos, en determinadas enfermedades de origen genético.

La técnica de hibridización in situ permite detectar secuencias específicas de ácidos nucleicos en cortes tisulares, células o cromosomas morfológicamentepreservados
Desarrollada originalmente por Pardue and Gall (1969), la técnica se limitó
inicialmente a los laboratorios de investigación ya que las sondas de detección
eran marcadas con materiales radioactivos. Posteriormente, con el desarrollo de
métodos de marcación no radioactivos se ampliaron las posibilidades para su uso
posibilitando incluso la marcación simultánea de variassecuencias de DNA la hibridización in situ en combinación con
inmunohistoquímica ofrece una visualización directa del ADN bacterial o antígenos
en tejidos afectados y, por medio de la microscopía de luz, observar
simultáneamente los cambios histopatológicos y la marcación
En general hay dos métodos para llevar a cabo la hibridación: los directos y los
indirectos. En los métodos directos, elmarcador a detectar está unido
directamente a la sonda de ácidos nucleicos para así formar híbridos que pueden
ser visualizados microscópicamente sin mediar otro tipo de reacción. Para este
método es esencial que el marcador permanezca estable en todo el proceso y no
interfiera con la hibridación. Las sondas marcadas con fluorocromos son el
ejemplo más característico de este método. En losprocedimientos indirectos la
sonda está marcada con un compuesto que no puede ser visualizado
directamente, por el contrario, una vez se produce la hibridación, éste necesita ser
detectado mediante métodos citoquímicos; un ejemplo de este tipo es el complejo
biotina-streptavidina-peroxidasa
La hibridación in situ es un procedimiento que incluye los siguientes pasos:
preparación delmaterial biológico, selección y marcación de la sonda, hibridación
con la sonda marcada, detección de la sonda, microscopía y análisis de la imagen.
Veamos a continuación cada uno de estos pasos en más detalle. Las secciones de tejido más comúnmente empleados por la hibridación in situ son:
tejidos congelados, los cuales son embebidos frescos en un medio de soporte
especial para sercortados por medio de un criostato; células en suspensión, las
cuales pueden ser puestas sobre una lamina y ser fijadas con metanol, y tejidos
fijados embebidos en parafina
La preparación de las células y cortes tisulares para la hibridación in situ emplea
usualmente fijadores de rutina para obtener el máximo de retención de las
secuencias de ADN de interés y mantener la morfología; dentro deésto se
encuentran la solución de metanol/ácido acético (3:1) usada para las
preparaciones de células y cromosomas, etanol al 70% para células en
suspensión, metanol o acetona para análisis citológico y formaldehido bufferado al
4% para cortes histológicos.otros han obtenido mejor coloración y preservación de la morfología celular y de la integridad de los acidos nucleicos con el uso de...