Pcr Tiempo Real

PCR TIEMPO REAL
OBJETIVOS:
Objetivo General
Conocer de forma práctica de la técnica de PCR (reacción en cadena de la polimerasa) para biología molecular.
Objetivos Específicos
* Conocer los reactivos y las concentraciones empleadas para realizar la Q- RT- PCR, y la importancia que tienen cada uno de estos.
* Verificar los genes asociados a un tumor de cáncer de mamá obtenido de uncultivo celular.

Introducción:
PCR en tiempo real (del inglés real time PCR) es una variante de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizada para amplificar y simultáneamente cuantificar de forma absoluta el producto de la amplificación de ácido desoxirribonucleico (ADN).
Un molde de ADN, al menos un par de cebadores específicos, dNTPs, un tampón de reacción adecuado, y una ADNpolimerasa termoestable; a dicha mezcla se le adiciona una sustancia marcada con un fluoróforo que, en un termociclador que albergue sensores para medir fluorescencia tras excitar el fluoróforo a la longitud de onda apropiada, permita medir la tasa de generación de uno o más productos específicos.[ ]Dicha medición, se realiza luego de cada ciclo de amplificación y es por esto que también se le denominaPCR en tiempo real.
Agentes intercalantes
SYBR ® Verde I versus TaqMan ® basados en ensayos
Hay dos tipos de químicos de fluorescencia de vigilancia disponibles para su uso en la ABI 7900HT, SYBR Green, y TaqMan La primera emplea a la ADN-colorante intercalante, SYBR Green como el reportero fluoróforo. Funciona como bromuro de etidio por medio de la unión de dos desamparados ADN, que es elproducto de la PCR. A medida que progresa el ciclo de la reacción, el instrumento supervisa y registra el aumento de la fluorescencia a través del tiempo. El SYBR Grenn ensayo validado sólo requiere un primer par además de los componentes regulares PCR.
El TaqMan utiliza la química FRET (transferencia de energía de resonancia de fluorescencia) la tecnología. Se requiere el uso de un nuevo tipode cartilla, llamado sonda, que es una etiqueta con un tinte fluorescente reportero sobre su 5 'y un extremo 3' quencher tinte. Aunque la sonda sigue intacta, el 5 'y el 3' tintes están muy cerca, y la señal fluorescente se apagará a través de FRET. Como producto de la PCR es sintetizada, la sonda, que se sienta en una secuencia específica en una región entre los primers adelante y atrás, escleaved por la nucleasa actividad de la polimerasa Taq. Como el 5 'reportero tinte es liberado, que continuamente fluoresces. Una sonda es cleaved para cada producto de PCR realizados durante la reacción, y la máquina registra la fluorescencia aumento concomitante en el tiempo.
Hay pros y los contras de cada uno de los químicos empleados para QPCR. Una de las ventajas de SYBR Green contra TaqMan esmás que el ensayo inicial de preparación sólo requiere de unos días para el primer tipo de diseño y validación. TaqMan requiere de la síntesis adicional de los productos de doble etiquetado sonda después de la validación de las posibles primer conjunto utilizando SYBR ® Green. La sonda síntesis usualmente toma 2-3 semanas, y es caro en relación con el costo de los primers. La crecientedisponibilidad de validados TaqMan sonda-primer conjuntos de varios proveedores pueden llevar los costos de este método.
En general, TaqMan ha sido considerado como más sensible cuando se detectan bajo número de copias ( 10 copias de la plantilla debido a los efectos estocásticos ® SYBR Green puede tener una ligera ventaja a la hora de la sensibilidad en> 10 copias debido a que el reportero se une acualquier tinte de doble varados ADN presente en la reacción, y no requiere de una sonda de división para el caso de detección de fluorescencia, al igual que TaqMan. El resultado es la detección de productos de la PCR en ciclos anteriores Esto es especialmente importante en el caso de las transcripciones de baja abundancia (> 10 copias), donde el número de ciclos de PCR para la detección de...