pH y soluciones Amortiguadoras

FACULTAD DE CIENCIAS NATURALES
LABORATORIO BIOQUÍMICA

Alumno: ___________________________________________ Código: _________________

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Práctica 10: ESTUDIO CINETICO DEL ENZIMA ALFA – AMILASA:
EFECTO DE LA CONCENTRACIÓN, EL pH Y LA TEMPERATURA SOBRE LA VELOCIDAD DE UNA REACCIÓN ENZIMÁTICA.1. FUNDAMENTO TEÓRICO
Estudio cinético del enzima α-amilasa.
Introducción a la enzimología.
La cinética enzimática tiene por objeto el estudio de la velocidad de las reacciones catalizadas por enzimas, así como los factores que en ella influyen y los mecanismos por los cuales transcurren las reacciones enzimáticas. La velocidad de las reacciones enzimáticas se puede medir:
1 Por la cantidadde sustrato que desaparece por unidad de tiempo.
2 Por la cantidad de producto que aparece por unidad de tiempo.
En esta práctica de laboratorio se comprobará la influencia de la concentración del sustrato [S], del enzima [E], el pH y la temperatura (T°C) sobre la velocidad de la reacción catalizada por el enzima α-amilasa salival, sobre los enlaces α-1,4 del almidón. Para ello nos basaremos enla desaparición del almidón por unidad de tiempo, mediante el seguimiento de la reacción de coloreada que produce el mismo, así como sus productos de hidrólisis, con el Iodo en disolución de Ioduro de potasio (Reactivo de Lugol).
Dado que el almidón está integrado por dos fracciones, la amilosa y la amilopectina, debe tenerse en cuenta las reacciones que ambas producen (así como sus respectivosproductos de hidrólisis) con el reactivo de Lugol:
Cuando se mezclan el almidón (mezcla de amilosa y amilopectina) y la amilasa salival con yodo, produce un color azul violeta. Mientras que sus productos de hidrólisis, maltosa, glucosa y dextrinas límite con el yodo no producen coloración.
Basándonos en las reacciones anteriores podemos estudiar el efecto que provocan en la cinética enzimáticala variación de los factores que en ella influyen: [S], [E], pH y T°C, fundamentalmente. La influencia de la [E] podremos estudiarla midiendo la velocidad de la reacción de la forma ya descrita pero utilizando diferentes [E], manteniendo constante los demás factores. De forma similar se procede con el estudio de la influencia de la [S]. En el caso del estudio de la influencia del pH y latemperatura se ensayará la actividad del enzima a diferentes valores de pH y T°C con la reacción del Lugol.
2. SEGURIDAD DURANTE LA PRÁCTICA


















3. TRABAJO INTEGRADO DE LABORATORIO
CONSULTAS PREVIAS.
1 ¿Cuáles son las características estructurales del almidón?
2 ¿Qué tipo de enzima es la α-amilasa salival?
3 ¿Cuáles son los productos que origina la acción de esteenzima sobre el almidón?
4 Explique cómo influyen en la velocidad de las reacciones enzimáticas una variación en la concentración del enzima presente, en la concentración del sustrato, el pH y la temperatura.
5 ¿Qué tipo de reacción se debe dar entre el lugol y el almidón y de qué forma a través de ésta reacción se puede determinar la presencia o ausencia de almidón?
6 ¿Cuál es el producto oproductos de la reacción de degradación del almidón por el enzima?

4. METODOLOGIA

4.1 MATERIALES

Tabla 1. Listado de materiales necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.
ITEM Cantidad
Gradilla 1
Tubos de ensayo pequeño 15
Pipeta pasteur 5
Vasos de precipitados de 250 mL 2
Vaso de precipitados de 25mL 1
Erlenmeyer de 50mL 1
Probeta 25 mL 1
Pipetas graduadas de 1mL y 10mL2 de c/u
Propipeta 1
Termómetro 1
Pinza para tubos de ensayo 1
Cronómetro 1
Frasco lavador 1
Varilla de vidrio 1
Placa de aglutinación 2
Estufa 1



4.2 REACTIVOS

Tabla 2. Listado de reactivos necesarios para el desarrollo de la práctica por pareja.
Reactivos Cantidad
Lugol 25mL
Almidón al 0,5% 30mL
Soluciones tampón de pH 4 2 mL
Soluciones tampón de pH 7 2 mL
Agua...