PO

PO5. Separación de pigmentós fótósinteticós de plantas
mediante crómatógrafía en cólumna (CC)
Objetivo
 Extraer los pigmentos de plantas mediante maceración o por extracción asistida por ultrasonidos (EAU)
 Separar los pigmentos mediante una cromatografía en columna

Fundamento
La cromatografía es una técnica de separación que se basa en la diferente distribución de los
componentes de unamezcla entre dos fases inmiscibles: la fase móvil (FM) y la fase estacionaria (FE). La FM
generalmente es un líquido o un gas que fluye de manera continua sobre la FE, la cual puede ser un sólido o
un líquido. La diferencia de afinidad entre cada uno de los
constituyentes de la mezcla con la FM y la FE produce un equilibrio
dinámico donde cada componente es selectiva y temporalmente
retenido por la FE,para luego ser removido por la FM. Aquellos
compuestos que son fuertemente retenidos por la FE se mueven
lentamente con el flujo de la FM; por el contrario, los que se unen
débilmente a la FE, se mueven con mayor rapidez. Como
consecuencia de las distintas movilidades los constituyentes de una
muestra se separan en bandas o zonas discretas las cuales pueden
analizarse cualitativa ocuantitativamente.
En la cromatografía en columna, la FE está depositada en
una columna, normalmente de vidrio, y tanto la muestra a analizar
como la FM son adicionadas por la parte superior de la columna,
permitiendo que fluyan a través de ésta por gravedad o por presión
externa.
La selección de la FE y la FM son decisiones que se deben analizar cuidadosamente para que la
separación cromatográfica sea óptima: Si la polaridad de los compuestos a separar y de la FM son similares, la FE no puede competir
efectivamente por los componentes de la muestra y no se produce la separación. Por eso,
normalmente, se suele elegir una FE con polaridad similar a la de los analitos.
 Un buen solvente debe permitir que la elución se desarrolle de manera lenta permitiendo el
establecimiento
del
equilibrio
necesarioentre la muestra y la FM y
FE, pero no tanto que los tiempos
de retención en la columna de los
componentes sean excesivamente
largos.

Si
se
quieren
obtener
buenas
separaciones en un tiempo razonable, las
polaridades del soluto, de la fase móvil y
de la fase estacionaria se han de
armonizar cuidadosamente. El mejor
solvente, o mezcla de solventes, se
decidirá siempre por ensayo-error.

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Cuando la FE es polar (cromatografía de fase normal), como en la alúmina o silicagel, se emplean
solventes orgánicos de baja o media polaridad. Los compuestos con grupos funcionales muy polares
(alcohol, carboxilo, amido, nitrilo), que son fuertemente atraídos por la FE, requerirán eluentes más polares
para ser liberados.
En esta práctica se van a extraer los pigmentos fotosintéticos quese
encuentran en los cloroplastos de las plantas verdes: clorofila-a (verde
intenso), clorofila-b (verde claro), xantofilas (amarillo claro) y carotenos
(amarillo anaranjado). Esto se va a realizar de dos maneras: por maceración
de las plantas en una mezcla de éter de petróleo y acetona, o mediante
extracción asistida por ultrasonidos.
A continuación, se separarán los mismos mediante cromatografíaen
columna, utilizando como FE silicagel y como FM éter de petróleo y acetona

Procedimiento
Extracción de los pigmentos fotosintéticos por maceración/EAU
1. Se trituran 25 g de plantas verdes, preferiblemente secadas al aire, con un poco de
arena lavada.
2. Se colocan las plantas trituradas en un vaso de precipitados al que se añade 10 mL
de acetona + 40 mL de éter de petróleo
3. Mientras unosgrupos dejan macerar las plantas en esta mezcla de disolventes un
tiempo de 15 minutos, otros colocan el vaso de precipitados en el baño de
ultrasonidos a 40ºC durante 15 minutos.
4. Se recoge el líquido por decantación y se filtra este líquido. Este líquido constituye
la muestra.
Preparación de la columna
5. Introducir una pequeña porción de algodón o lana de vidrio en forma de galleta
dentro de...