Practica 4

Universidad Veracruzana
Facultad de Química Farmacéutica Biológica

Experiencia Educativa:
Laboratorio de Biología Molecular Aplicada

Catedrático:
Clara Elena Yerena Aguilar

Practica # 4
“Aplicación de la Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) multiplex para la identificación del genotipo de la GSTT1 y GSTM1”




Alumna: Miriam Castillo Castillo.
Fecha de entrega: 06 demayo de 2014
OBJETIVO
Comprender el fundamento y la actividad que tienen cada uno de los reactivos utilizados en PCR multiplex
Aplicar la técnica de PCR multiplex para identificar el genotipo GSTT1 y GSTM1

INTRODUCCIÓN
PCR múltiplex: Técnica de PCR que permite la detección simultánea de más de una secuencia de genomas diferentes en una sola reacción mediante el empleo de dos o más parejasde cebadores. Todos los cebadores deberán reaccionar a una Temperatura de fusión (Tm) similar, dentro de un rango de +/-5°C. Los tamaños de los productos amplificados de la PCR deberán ser también semejantes pero distinguibles, entre unos valores de 200 a 500 pares de bases (pb).
Las glutation S-transferasas pertenecen a una familia de enzimas de gran importancia en mecanismos de desintoxicacióncelular, eliminando xenobióticos o substancias nocivas para las células. Estas enzimas catalizan el ataque nucleofílico del sustrato fisiológico, glutation reducido ó GSH (g-Glu-Cys-Gly) sobre el centro electrófilo de un gran número de estructuras tóxicas. En mamíferos estas isoenzimas (GSTs) existen como homdímeros o como heterodímeros, tienen una masa molecular de aproximadamente 25 kDa porsubunidad y un sitio activo por monómero. Se clasifican en siete familias (alpha, kappa, mu, pi, sigma, theta y zeta) que se diferencian tanto en su secuencia, propiedades inmunológicas y papel fisológico
En los seres humanos , existen cinco clases de genes GST : α ( GSTA ) , μ ( GSTM ) , π ( SGPC ) , θ ( GSTT ) , y ζ ( GSTZ ) con uno o más genes en cada clase . Las enzimas tienen diferentes, peroa veces se superponen, afinidad por el sustrato. Los tres GSTs más intensamente estudiados son GSTM1, GSTT1 y GSTP1.
Los polimorfismos genéticos que resultan en la falta de actividad de la enzima debido a la deleción homocigota de los genes GSTM1 y GSTT1 ya se han descrito. Las frecuencias de las deleciones varían entre poblaciones . En los caucásicos, las frecuencias de deleciones homocigóticasson aproximadamente 0,50 para GSTM1 y 0,10 a 0,20 para GSTT1.1 , 2,3 La mayoría de los estudios que investigan el efecto de los polimorfismos genéticos en GSTM1 y GSTT1 no distinguen entre los individuos con una o dos copias de los genes . Sin embargo, existe un patrón de fenotipo trimodal en la que los individuos con dos, uno , o no hay enzimas funcionales son rápidos , intermedia , y lento " deconjugación , " respectivamente2 , 4
El gen GSTP1 muestra un polimorfismo en el codón 105 ( Ile105Val ) , dando como resultado una enzima con sustrato alterado affinity.5 Aproximadamente el 10 % de los caucásicos son homocigotos para esta mutación y el 40% son heterocigotos.6 , 7,8 La enzima GSTP1 se asocia con resistencia a ciertos fármacos contra el cáncer y para el riesgo de desarrollaralgunos tipos de cáncer.
En los últimos años , muchos grupos han investigado los posibles efectos de las variantes genéticas de GSTM1 , GSTT1 , y los genes GSTP1 en relación a diversos factores , especialmente la susceptibilidad al cáncer y la eficacia de tratamiento contra el cáncer.
Los análisis que son capaces de distinguir entre los individuos con dos, uno , o ninguna enzima GSTM1 y GSTT1funcionales pueden ser utilizados para investigar si los genes que influyen en el tema estudiado de una manera dependiente de la dosis .
FUNDAMENTO
El proceso que tiene lugar durante la PCR se puede resumir de la siguiente forma: partiendo de un DNA molde, una enzima polimerasa incorpora nucleótidos complementarios a partir de la zona de doble cadena originada por la unión de los cebadores al molde....