Practicas Biología Ciencias Ambientales Uned
Páginas: 20 (4994 palabras)
Publicado: 9 de enero de 2013
ACIDOS NUCLEICOS
A.- Describa los fundamentos de la extracción de ADN, indicando la función de cada uno de los componentes del tampón de extracción así como de los pasos del protocolo.
El objetivo de la prácticas es la extracción del ADN genómico, es decir el que se encuentra en el núcleo y que contiene la mayoría de los genes. Para ello se procede, en primer lugar, a homogeneizar el materialempleado (guisantes) mediante la combinación de la acción mecánica y de detergentes que nos van a ayudar a romper las membranas celulares. Los detergentes además, al tener actividad inhibitoria, evitan que al romper los lisosomas determinadas enzimas actúen y degraden el ADN. En segundo lugar, vamos a desechar los grandes fragmentos celulares que no nos interesan mediante una filtración yfinalmente vamos a recuperar el ADN por precipitación alcohólica.
La función de los materiales empleados es:
- Detergente: (generalmente SDS): Su función es romper las bicapas lipídicas de las membranas y unirse a las cargas positivas de las proteínas de los cromosomas liberando el ADN a la disolución.
- EDTA : Secuestra los cationes Mg 2+ que necesitan las enzimas que degradan el ADN para llevar acabo su actividad.
- NaCl : Mantiene la doble hélice y libera las histonas del ADN.
- Etanol: El ADN no es soluble en alcohol debido a su polaridad.
Protocolo:
1. Preparar 100 ml de solución de lisis. Poner 800 ml de agua en un vaso de precipitado de 200 ml y diluir 0,9 gr de cloruro sódico y 0,3 gr de EDTA. Añadir 1 ml de SDS al 10% y enrasar hasta 100 ml.
2. Tomar 25 gr de guisantes yponerlos en un vaso de 600 ml. Añadir la solución de lisis y batir con una batidora a máxima velocidad durante unos segundos.
3. Incubar durante 10 minutos a 55º. Agitar suavemente cada 5 minutos.
4. Poner 5 minutos en hielo.
5. Filtrar con triple capa de gasa de embudo.
6. Poner 2 ml de solución en un tubo de plástico. Añadir 5 ml de etanol frío (-20ºC).
7. Recuperar el ADN con una pipetaPasteur. Resuspender en 500 ml de agua destilada.
B.- El ADN obtenido se puede emplear en diversas técnicas de laboratorio, entre ellas la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el Southern Blot. Explique en qué consisten y la utilidad que tienen estas dos técnicas.
La reacción en cadena de la polimerasa permite conseguir un número de copias de ADN en un número crecienteexponencialmente, ya que a partir de una copia se obtienen dos, a partir de esas dos se obtienen otras cuatro y así sucesivamente, pues se trata de un proceso cíclico que se puede repetir tantas veces como se quiera. Tiene una gran utilidad en genética y biología molecular.
El Southern Blot es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla complejade este ácido nucleico. Para ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar en base a la longitud de los fragmentos de ADN. Después, para la detección del fragmento de interés en la membrana, utilizamos otro fragmento de ADN o ARN que se llama sonda y que contiene la secuencia complementaria al fragmento que queremos identificar. La sonda, se marca con un isótoporadiactivo, se agrega a una solución y se incuba con la membrana. Esta hibridización, hace que la sonda se adhiera al fragmento de ADN en la membrana, el cual contiene las bases complementarias. Al exponer la membrana a una película de fotografía, podemos identificar el fragmento y establecer así si está o no está contenido en el ADN que estamos estudiando. Es una electroforesis seguida de unatransferencia. Sirve por ejemplo para identificar mutaciones en el genoma y es por ello muy útil para diagnosticar diversas enfermedades. Se puede utilizar la PCR como tamizaje inicial para detectar alelos normales y después Southern blot para detectar expansiones de mayor tamaño y confirmar el diagnóstico.
ENZIMAS Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
A.- Indique el resultado obtenido en cada parte de la...
A.- Describa los fundamentos de la extracción de ADN, indicando la función de cada uno de los componentes del tampón de extracción así como de los pasos del protocolo.
El objetivo de la prácticas es la extracción del ADN genómico, es decir el que se encuentra en el núcleo y que contiene la mayoría de los genes. Para ello se procede, en primer lugar, a homogeneizar el materialempleado (guisantes) mediante la combinación de la acción mecánica y de detergentes que nos van a ayudar a romper las membranas celulares. Los detergentes además, al tener actividad inhibitoria, evitan que al romper los lisosomas determinadas enzimas actúen y degraden el ADN. En segundo lugar, vamos a desechar los grandes fragmentos celulares que no nos interesan mediante una filtración yfinalmente vamos a recuperar el ADN por precipitación alcohólica.
La función de los materiales empleados es:
- Detergente: (generalmente SDS): Su función es romper las bicapas lipídicas de las membranas y unirse a las cargas positivas de las proteínas de los cromosomas liberando el ADN a la disolución.
- EDTA : Secuestra los cationes Mg 2+ que necesitan las enzimas que degradan el ADN para llevar acabo su actividad.
- NaCl : Mantiene la doble hélice y libera las histonas del ADN.
- Etanol: El ADN no es soluble en alcohol debido a su polaridad.
Protocolo:
1. Preparar 100 ml de solución de lisis. Poner 800 ml de agua en un vaso de precipitado de 200 ml y diluir 0,9 gr de cloruro sódico y 0,3 gr de EDTA. Añadir 1 ml de SDS al 10% y enrasar hasta 100 ml.
2. Tomar 25 gr de guisantes yponerlos en un vaso de 600 ml. Añadir la solución de lisis y batir con una batidora a máxima velocidad durante unos segundos.
3. Incubar durante 10 minutos a 55º. Agitar suavemente cada 5 minutos.
4. Poner 5 minutos en hielo.
5. Filtrar con triple capa de gasa de embudo.
6. Poner 2 ml de solución en un tubo de plástico. Añadir 5 ml de etanol frío (-20ºC).
7. Recuperar el ADN con una pipetaPasteur. Resuspender en 500 ml de agua destilada.
B.- El ADN obtenido se puede emplear en diversas técnicas de laboratorio, entre ellas la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el Southern Blot. Explique en qué consisten y la utilidad que tienen estas dos técnicas.
La reacción en cadena de la polimerasa permite conseguir un número de copias de ADN en un número crecienteexponencialmente, ya que a partir de una copia se obtienen dos, a partir de esas dos se obtienen otras cuatro y así sucesivamente, pues se trata de un proceso cíclico que se puede repetir tantas veces como se quiera. Tiene una gran utilidad en genética y biología molecular.
El Southern Blot es un método de biología molecular que permite detectar la presencia de una secuencia de ADN en una mezcla complejade este ácido nucleico. Para ello, emplea la técnica de electroforesis en gel de agarosa con el fin de separar en base a la longitud de los fragmentos de ADN. Después, para la detección del fragmento de interés en la membrana, utilizamos otro fragmento de ADN o ARN que se llama sonda y que contiene la secuencia complementaria al fragmento que queremos identificar. La sonda, se marca con un isótoporadiactivo, se agrega a una solución y se incuba con la membrana. Esta hibridización, hace que la sonda se adhiera al fragmento de ADN en la membrana, el cual contiene las bases complementarias. Al exponer la membrana a una película de fotografía, podemos identificar el fragmento y establecer así si está o no está contenido en el ADN que estamos estudiando. Es una electroforesis seguida de unatransferencia. Sirve por ejemplo para identificar mutaciones en el genoma y es por ello muy útil para diagnosticar diversas enfermedades. Se puede utilizar la PCR como tamizaje inicial para detectar alelos normales y después Southern blot para detectar expansiones de mayor tamaño y confirmar el diagnóstico.
ENZIMAS Y ACTIVIDAD ENZIMÁTICA
A.- Indique el resultado obtenido en cada parte de la...
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