practico bioquímica 2013 numero 3

Universidad de Chile
Facultad Cs. Químicas y Farmacéuticas
Departamento De Bioquímica

Informe Trabajo Práctico N°3
“ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR
ELECTROFORESIS EN GELES
DESNATURANTES DE POLIACRILAMIDA”

Integrantes


Fecha trabajo
práctico
Fecha de entrega

:

10 / 05 / 2013

:

24 / 05/ 2013
1

Introducción
La electroforesis en geles de poliacrilamida es uno de losmétodos más utilizados para la
purificación, análisis y caracterización de proteínas. Esta técnica permite separar moléculas
cargadas y presenta las diferencias en movilidad cuando se les somete a la acción de un
campo eléctrico [1]. El fenómeno denominado electroforesis sucede cuando una molécula
con una carga neta en solución se desplaza por acción de una campo eléctrico; de esta
manera lamolécula migra hacia uno u otro electrodo según su carga: los aniones (-) irán
hacia el ánodo (+) y los cationes (+) hacia el cátodo (-). En estas condiciones las moléculas
disueltas migran a una velocidad proporcional a la relación carga/masa. Por lo tanto la
velocidad de migración en estas condiciones a través del campo eléctrico dependerá de:
carga neta, tamaño y forma de la molécula, fuerza delcampo eléctrico, fuerza iónica,
viscosidad y temperatura del medio. La electroforesis se lleva a cabo sobre un soporte
inerte, generalmente se realizan sobre matrices que sirven de tamices moleculares que
potencian la separación. Las moléculas más pequeñas que los poros se desplazan fácilmente
a través de él, mientras que las de mayor tamaño quedan retenidas y las intermedias se
desplazan condistinto grado de dificultad dependiendo de su tamaño. [2]
Entre las diversas técnicas de electroforesis en gel de poliacrilamida (PAGE, por sus siglas
en inglés "polyacrylamide gel electrophoresis"), probablemente la más utilizada es la
modalidad que se lleva a cabo en presencia del detergente duodecilsulfato de sodio
(SDSPAGE), tanto para analizar mezclas de proteínas, como para sercombinada con
técnicas de inmunoelectrotransferencia. En la técnica de SDS-PAGE, se mezclan las
proteínas con el detergente aniónico SDS para formar complejos desnaturalizados, cargados
negativamente. La cantidad de SDS unido a las proteínas es proporcional a su tamaño: el
SDS se une en una proporción aproximada de 1,4 g SDS/g proteína. Los complejos
proteína/SDS poseen una estructura elipsoide o debastón, donde la cadena proteica es
distendida y solubilizada por el detergente. Dado que la relación final carga/masa queda
constante para las distintas proteínas (se anula su carga intrínseca), estas van a ser
separadas en el gel poroso fundamentalmente con base en sus diferencias de peso molecular
(PM): a menor tamaño, mayor movilidad de la proteína, y viceversa. Se deduce de lo
anteriorque esta técnica permite estimar el peso molecular (PM) de una proteína,
comparando su movilidad electroforética con la de proteínas de PM conocido. La
determinación del PM de proteínas mediante SDS-PAGE es válida cuando se analizan
cadenas proteicas individuales (subunidades), en donde se han reducido todos los enlaces
disulfuro y por ende, se ha distendido toda la cadena proteica para suinteracción con el
SDS. Bajo estas condiciones, la migración de las moléculas obedece fundamentalmente a
su PM. No obstante, en ocasiones es útil analizar muestras no reducidas de una proteína,
por ejemplo, para evaluar su composición de subunidades. En tal caso, la movilidad
electroforética en SDS-PAGE, aunque guarda una cierta relación con el PM, no
necesariamente corresponde con su PM exacto,dependiendo de la forma y los pliegues
causados por los enlaces disulfuro, que seguirían intactos aún después de la interacción
SDS-proteína, en condiciones no-reductoras. [3]

2

Objetivos




Comprender el principio de separación de proteínas en un gel SDS-PAGE
Analizar el patrón de separación de proteínas de distintas muestras.
Comprender la importancia de esta técnica con...