preparacion de celulas y cultivo celular

Preparación de células y cultivo celular. Las células endoteliales
se obtuvieron a partir de las venas del cordón umbilical humano mediante una adaptación
del método de Maruyama. Una técnica estéril
se utilizó en todas las manipulaciones de la cuerda. El cable era
separado de la placenta poco después del nacimiento, colocado en un estéril
recipiente lleno con tampón de cable (0,14 M deNaCl, 0,004 M KCl,
0,001 M de tampón fosfato, pH 7,4, 0,011 M de glucosa), y se mantiene
a 40 º C hasta su procesamiento. El tiempo de almacenamiento promedio de alrededor de 1 h, y
cuerdas fueron descartados si se mantiene más de 3 h. El cable era
inspeccionados, y todas las áreas con marcas de la abrazadera se cortan. la
vena umbilical se canuló con una aguja de punta roma de calibre 14,
2 cmde largo, y la aguja fue asegurado por el pinzamiento del cordón
sobre la aguja con un lazo de cordón umbilical. La vena se perfundió con 100 ml de tampón de cable a lavar la sangre y se deja escurrir. El otro extremo de
a continuación, la vena umbilical se canuló con un objeto contundente, sin cubo,
Calibre 12 eje de la aguja sobre la cual se deslizó una longitud 4 cm
de * de tubería depolietileno de diámetro exterior. 10 ml de 0,2% de colagenasa
en tampón de cable a continuación, se infundió en la vena umbilical, y
el tubo de polietileno se sujetó se cerró con una pinza hemostática. El cordón umbilical, suspendida por sus extremos, se colocó en un
baño de agua que contiene tampón de cable y se incubaron a 370C
durante 15 min. Después de la incubación, la solución que contienecolagenasa
las células endoteliales se lavó abundantemente desde el cable por
la perfusión con 30 ml de tampón de cable. El efluente se recogió
en 50 ml de un tubo de centrífuga cónico estéril que contiene 10 ml de medio
199 (TC 199) 'con 20% de suero de ternera fetal (FCS). las células
se sedimentaron a 250 g durante 10 min y se lavó una vez con
Se resuspendió 20 ml de TC 199 a 20% de FCS, yel botón de células
por trituración en 5 ml de medio de cultivo fresco. la
rendimiento a partir de este procedimiento fue en el rango de 0,5-1,5 X 108
las células. La suspensión celular se divide en partes iguales entre los cuatro
a seis platos de plástico de 35 mm de Petri.
A continuación, se añadió medio suficiente para hacer un volumen final de
2 ml / placa. Las células endoteliales secultivaron en TC 199 que contiene
20% de FCS, penicilina (200 U / ml), estreptomicina (200
, xg / ml), y L-glutamina (2 mM).
Las placas se incubaron a 370C bajo 5% C02. Las células se alimentaron dos veces a la semana con un cambio completo de medio de cultivo fresco.
Para subcultivo, se recogieron las células con 0,01% de EDTA 0,1% de colagenasa.
Las células musculares lisas se cultivaron apartir de las venas del cordón umbilical mediante una modificación menor de la técnica anterior. Antes de colagenasa de perfusión de la vena, todo el cordón estaba traumatizada por apriete repetidamente con una pinza hemostática.
A continuación, se siguió el procedimiento habitual. Los efluentes células cuando se cultivan produjeron una población mixta de células endoteliales y células largas enforma de huso.
Estas últimas células sobrecrecidas las células endoteliales dentro de 2 semanas y formaron una población pura de células en forma de huso que crecen en múltiples capas.
Ellos fueron identificados como células del músculo liso por criterios ultraestructurales.
Los fibroblastos se derivaron de la piel normal obtenido en la cirugía. El material de partida se recorta para eliminar laepidermis y el tejido conectivo dérmico se desmenuzó en trozos de aproximadamente 1 X 1 mm.
Los fragmentos de tejido conectivo se incubaron con 0,2% o colagenasa en tampón de cable durante 5 horas a 370C.
La mezcla de incubación se centrifugó a 250 g durante 10 min. El material sedimentado se lavó tres veces y se resuspendieron en medio de cultivo, y la suspensión
se pipeteó en placas de...