Proteinas Raf

PROTEINAS RAF
PAPEL EN LA PROLIFERACION, APOPTOSIS Y TRANSFORMACION CELULAR

ANTONIO CHILOECHES GÁLVEZ Departamento de Bioquímica y Biología Molecular Universidad de Alcalá

Cascada Ras-RAF-MEK-ERK

Factores crecimiento
espacio extracelular

membrana plasmática

citoplasma

sustratos

nucleo

sustratos

Señalización proteínas Ras

RAF
GTP GDP

GEFs

PI3K RAS
GTPGDP

RAS
GAPs
Pi

inactive

active

RalGDS

PLCγ

Mutaciones oncogénicas: V12, L61

Señalización proteínas Ras Integrinas RTKs GPCRs

p85 p110

YPG rb 2

α β γ

So s

? RAS
Y40C

?
RalGDS
RhoA PLD1 Ral RalBP1 Cdc42/Rac

T37G

E35S

RAF
MEK ERK Elk-1

PI3K
PtdIns(4,5)P2 AKT/PKB

PLCγ
PtdIns(3,4,5)P3 Cdc42/RacGEF

Cdc42/Rac

Proliferación/DiferenciaciónSupervivencia celular Apoptosis/Transformación Organización citoesqueleto

Cascada Ras-RAF-MEK-ERK

Proliferación-Diferenciación-Apoptosis

Cascada Ras-RAF-MEK-ERK

Y

P

Grb2

Sos

RAS

GTP

GDP

RAF
RalGDS
Enzimas Metabólicas Proteínas Citoesqueleto Mediadores inflamación Otras Ser/Thr quinasas ATF-2

PI3K

MEK

P

P P

Supervivencia celular

ERK

Elk-1Remodelación cromatina

Factores de transcripción

Crecimiento celular/Transformación/Diferenciación

Estructura proteínas RAF
Segmento activación

RBD

CRD

N-region

Regulador

Catalítico

- Serina/Treonina quinasa citosólicas específicas - Tres isoformas diferentes: A-RAF, B-RAF y C-RAF (Raf-1) - Dominio N-terminal regulador actúa como un dominio autoinhibidor, y un dominiocatalítico - Tres regiones conservadas: CR1, CR2 and CR3 - RBD - Ras binding domain - CRD- Cysteine rich domain

Activación proteínas RAF

YP

Grb2

Sos

RAS

- Interacción lípidos - Interacción proteínas - Dimerización - Fosforilación

RAF intermediario

CR2

CRD

RBD CR1

RAF inactivo

143-3

143-3

MEK

CR3

143-3

143-3

ERK

Estructura proteínas RAF

-Fosforilación por PKA, inhibición

- Sitios de unión proteínas 14-3-3 parece requerir únicamente la interacción con una es equivalente a S338 de B-RAF activado. La activaciónde C-RAF.
proteína G pequeña en la membrana plasmática . - Sitios de autofosforilación

-- Fosforilación dede la completamente y noa Y341, sin embargo S445 de B-RAF a Src B-RAF carece S445 es constitutiva por Ras oncogénicosolo y no responde es activado tirosina equivalente es estimulada por Ras.

Diferente activación proteínas RAF por Ras y Src

Ensayo en cascada de quinasas IP RAF RAF
actividad quinasa RAF (cpm)
125000

100000

Ensayo actividad quinasa con 32P-ATP

75000

50000

GST-MEK P

25000

GST-ERK P

0

__

__

s Ra

c Sr

rc /S as R

Ra

s

c Sr

rc /S as R

MBP PC-RAF

B-RAF

Contar radiactividad

Sustratos proteínas RAF

apoptosis

proliferación, diferenciación, senescencia, transformación

Fenotipo de ratones a-raf-/-

-Los ratones mueren entre el día 7 y 21 postparto.

- Anormalidades intestinales.

- Desordenes alimentarios.

- Desordenes neurológicos.

- Rigidez de la musculatura, movimientos anormales.

Fenotipo deratones b-raf-/-

- Los ratones mueren durante el desarrollo embrionario, entre los días 10.5 y 12.5.

- Numerosas hemorragias internas debidas a la muerte por apoptosis de células endoteliales diferenciadas.

- Defectos neuronales por un mal crecimiento del tejido nervioso y una mala diferenciación del neuroepitelio.

Fenotipo de ratones c-raf -/c-raf-/- es letal durante el desarrolloembrionario H and E Ki67 Tunel

+/+

-/-

Fenotipo de los ratones mutantes c-rafFF/FF

C-RAF wt: C-RAF FF:
1
RBD CRD

338SSYY341 445SSFF448

N-region CR2
Y341 S338

648 CR3

C-RAF

CR1

Sin actividad quinasa

- Animales homocigotos raf-1FF/FF son fértiles, sobreviven la esperanza de vida esperada, son normales en peso y comportamiento. - Las células T de estos animales...