Protocolo de ic

Protocolo Completo de Inmunohistoquímica:

Soluciones:

1) Soluciones de Xilol y Etanol (100%, 95% y 80%): estas soluciones se preparan en 2 frascos (200 mL), conteniendo el primero la solución contaminada y el segundo la solución pura.
Etanol 95%: 190 ml de etanol 100% + 10 ml de H2Od.
Etanol 80%: 160 ml de etanol 100% + 20 ml de H2Od.

2) Buffer citrato 10 mM (pH=6): Citrato de sodio0,7352 gr. C6H5O7.2H2O (PM: 294,1 gr./mol) + 250 mL H2Od.

3) Solución para Ac. Secundario: para 1L de PBS, se agregan 3ml de tween.
Para 50 ml de Buffer de ac. Secundario:
PBS 1x………………………..50 ml
3% BSA……………………….1,5 g
Tween 0,3%............................150 ul
El tween20 se denomina: poliexietilensorbitano monolaureato

4) solución de bloqueo: PBS albúmina azida (stock)

5)Formalina 10% (P/100 mL)
Formaldehído (37%)………….10 mL
H2O destillada.………………..90 mL
NaH2PO4………………………400 mg
Na2HPO4 ……………………...650 mg

Silanización de portaobjetos:

Manipular los portas con pinzas y guantes, y trabajar los pasos que contienen acetona bajo campana.
- lavar portas con agua caliente y detergente
- enjuagar con agua destilada
- lavar con alcohol ácido (99 mL alcohol etílico 100%mas 1 mL HCl 1N -100ul del concentrado de la botella-)
- secar porta por porta con papel o dejar que se sequen al aire
- acetona 1 minuto (en baso de precipitado de vidrio, por la acetona).
- Sumergir unos segundos en Silano-acetona (1 mL de silano mas 46 mL acetona)
- Dejar secar al aire dentro de cajas histologicas, evitando que se chorree acetona (derrite las cajas histologicas).

NOMBRECOMERCIAL DEL SILANO: producto number en argentina 281778 en catalogo A1435-100ML EA ARS ARS. 3-AMINOPROPYLTRIMETHOXYSILANE, 97% 1,000 232,55/EA 232,55 pesos

Gelatinización de portaobjetos:

• 0,5 gr. gelatina (comercial sin sabor)
• 0.5 g K2Cr2O7
• 100 mL H2O

Calentar el H2O 50°C, lentamente agregar la gelatina mientras se esta agitando, enfriar a Temperatura Ambiente y agregar elcromo alumbre. FILTRAR, sumergir los portas en la gelatina cromo-alumbre y dejar secar a 37°C mínimo 2 hs (mejor overnight).

Protocolo de procesado de muestras hasta inclusión en parafina

Las muestras de tejido recien extraídas se dejan alrededor de 24 hs (no más de este tiempo) en formol buffer (en heladera). Después de concluido este tiempo se realizan:
• 2 lavados con PBS 1X de 10 min.cada uno
• se dejaron en alcohol 70% en heladera, hasta su procesado.
Procesado de tejido:
• 1 pasaje por Alcohol 80 %, 1 h a temperatura ambiente
• 1 pasaje por Alcohol 90%, 1 h a temperatura ambiente
• 1 pasaje por Alcohol 96 %, 1 h a temperatura ambiente
• 2 pasajes por solución deshidratante, de 1 h cada uno a temperatura ambiente
• 2 pasajes por xilol, 1 h cada uno a temperaturaambiente
• 2 pasajes por Parafina a 56°C de 2 hs, cada uno
• Armado de los tacos.

ACLARACION: si las parafinas no se encuentran bien derretidas, se pueden calentar previamente en baño de agua y dejar tomar temperatura dentro de la estufa, dado que la temperatura de la misma al colocar las muestras debe estar entre 56 y 60°C. no se deben superar los 60°C o se quemaría el tejido.

Protocolo deInmunohistoquímica:

1) Obtención de cortes histológicos: Llevar a cortar cortes de 4 µm a Alejandra, los cuales se montarán sobre portaobjetos silanizados o gelatinizados. La duración de los mismos es de 3 meses.
2) Secado de cortes histológicos: Dejar overnight en estufa de 60° C. Y trabajar con protocolo de tinción al día siguiente.
Observación: Los preparados deben estar bien secos (sinagua) para lo cual se colocan en estufa a 56° C overnight.

Protocolo de Inmunohistoquímica:

PRIMER DÍA

Desparafinización e hidratación:
Xileno
Etanol 100%
Etanol 95%
Etanol 80%
H2O destilada 2 lavados de 10 min. c/u
2 lavados de 5 min. c/u
2 lavados de 5 min. c/u
2 lavados de 5 min. c/u
2 lavados de 5 min. c/u
Desenmascaramiento del antígeno (retrieval):
Colocar portaobjetos...