Protocolo genotipifación de peces

Protocolo

Genotipificación de Peces

(A)Extracción del DNA genómico de colas del pez cebra:

1. Anestesiar al animal en tricaina disuelta en agua del sistema al 0,2%. Alternativamente,tomar 630 microlitros de tricaína y completar 15ml con agua del sistema. Luego depositar la solución en una placa de Petri, donde se pondrá el pez para que este sea anestesiado. Cuando el pez estécompletamente anestesiado no se moverá pero seguirá respirando (ver movimiento del opérculo).

2. Poner el pez ya anestesiado sobre una placa de plástico y cortar la aleta caudal antes que empiece lamusculatura, teniendo la precaución de que el animal no sangre.

3. Treansferir la cola a un tubo Eppendorf con 100 microlitros de buffer de lisis

Buffer de lisis (50 ml):

100 mM Tris pH8……………………………….....0,60 gr (Merk)
100 mM NaCl ……………………………………...0,2920 gr (Winkler)
10mM EDTA (ácido etilendiminotetraacético)……1,460 gr (Sigma)
0.2% SDS (dodecilsufato sódico)………………….1,440 gr (Merk)

Antes deusar, agregar a cada tubo Eppendorff, conteniendo 100 microlitros del buffer de lisis con las colas, 2 microlitros
de Proteinasa K del stock (10mg/ml)

4. Una vez terminado el proceso anteriorincubar los tubos Eppendorf por 2h a 55 ºC en el Termoblaker.

5. Cuando se han completado las 2 horas, centrifugar los tubos Eppendorf por 10 minutos a 13.000 rpm. (Los tubos deben colocarse en lacentrifuga frente a frente para que haya equilibrio, si el número de tubos es impar poner un tubo vacío para equilibrar)

6. Terminada la centrifugación extraer de los tubos Eppendorf 50 microlitrosdel sobrenadante y verterlo en un nuevo tubo.

7. Precipitar el DNA con 150 µl de Etanol (pro análisis) al 100% en el mismo tubo. Se debe mezclar y nuevamente centrifugar por 10 minutos a 13.000rpm.

8. Una vez centrifugado sacar el sobrenadante y lavar el pellet con 150 µl de Etanol al 70% (preparado del alcohol 100% pro análisis) y posteriormente centrifugar por 10 minutos a...