Purificación De La Enzima Lactato Deshidrogenasa De Músculo Esquelético De Pollo

UNIVERSIDAD NACIONAL AUTÓNOMA DE MÉXICO
FACULTAD DE QUÍMICA
BIOQUÍMICA EXPERIMENTAL (0141)

PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA LACTATO DESHIDROGENASA DE MÚSCULO ESQUELÉTICO DE POLLO

OBJETIVOS
* Purificar la enzima Lactato Deshidrogenasa (LDH) a partir de músculo esquelético de pollo
* Conocer las propiedades físicoquímicas de las proteínas (carga, punto isoeléctrico, masa molecular yafinidad) y relacionar las propiedades fisicoquímicas de las proteínas con el fundamento de las técnicas utilizadas en la purificación de proteínas: Centrifugación diferencial, precipitación por salado, cromatografía en filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico y cromatografía de afinidad
* Aplicar las técnicas de centrifugación y precipitación por salado como técnicas iniciales depurificación de una proteína.
* Adquirir la habilidad para analizar el progreso de la purificación de una proteína.
* Analizar el progreso de la purificación de una proteína.
* Aplicar la electroforesis como una herramienta para monitorear la pureza de una proteína.
* Adquirir la habilidad para medir la actividad de una enzima utilizando un método espectrofotométrico.
*Determinar la actividad de la LDH en las diferentes fracciones de purificación

INTRODUCCIÓN
La Purificación es el proceso que cuenta con varias etapas cuyo objetivo es lograr la concentración diferencial de la proteína o molécula de interés.

Métodos de rotura celular y extracción de proteínas
El primer paso en el aislamiento de una proteína es la rotura celular, para posteriormente poderextraer la proteína con un tampón adecuado. El método de rotura a elegir depende de las características mecánicas del tejido o células de donde se va a aislar la proteína, así como de su localización. Entre los distintos métodos ellos están:
* Lisis celular. Válido para células sin pared celular (ej. células de tejidos animales), pero no es suficiente para células vegetales o bacterias.Consiste en suspender las células en una solución hipotónica. Debido a la diferencia osmótica el agua difunde al interior de la célula, causando su hinchamiento y rotura.

* Destrucción mecánica. Entre estos métodos se encuentran la homogenización (hacer pasar las células entre un tubo y un pistón de vidrio que ajustan casi totalmente); moler en un mortero con arena o alúmina; molino con perlas devidrio, la prensa de French (que hace pasar las células a gran velocidad a través de un pequeño orificio), la sonicación (someter las células a vibraciones de ultrasonido).
* Congelación-descongelación. La rotura se produce al someter las células a un cambio brusco de temperatura, congelando primero a -196 ºC (con nitrógeno líquido) y pasándolas rápidamente a temperatura ambiente (25 ºC).* Proteína de asociación subcelular: Separación del resto del material celular a través de centrifugación diferencial

Una vez que la proteína se ha extraído de su entorno natural está expuesta a muchos agentes que pueden dañarla:
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* Cambios bruscos de pH, ácidos y bases fuertes
* Temperaturas extremas
* Acción de las proteasasSe requiere:
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* Disoluciones tamponadas
* Bajas temperaturas (4˚C)
* Proceso sea lo más corto posible
* Inhibidores de proteasas.

* Añadir el tampón de extracción agentes protectores de grupos funcionales específicos de la proteína

Métodos de separación y purificación de proteínas





Cromatografía de exclusión molecular (filtración en gel).En esta técnica las moléculas se separan según su forma y tamaño. La fase estacionaria está compuesta por microesferas de material hidratado esponjoso que contiene poros con un rango relativamente estrecho de diámetros. Si en una columna esos “tamices moleculares” se pasa una solución acuosa con moléculas de distintos tamaños, las que son demasido grandes para ingresar en los poros se excluyen...