Reacción En Cadena De La Polimerasa

PCR-reacción en cadena de la polimerasa

Bibliografía básica

Bibliografía básica
• 02 Basic molecular biology • 04 Purification and separation of nucleic acids • 05 Cutting and joining DNA •09 Polymerase chain reaction • 10 DNA sequencing

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Bibliografía básica

• 1 Optimization of PCRs

ENZIMAS-polimerasas

Enzimas
• Taq ADN Polimerasa ADNpolimerasa de Thermus aquaticus que cataliza la síntesis de ADN de 5’3’. Enzima termoestable: soporta 95 ºC /40 min. No posee actividad de exonucleasa correctora (proofreading) de 3’  5’ y posee bajaactividad de exonucleasa de 5’  3’.

Componentes de la PCR • ADN templado Plásmido: 0.01-1ng, Cromosomal: 0.1-1 ng en una mezcla de reacción de 50µl. - Concentraciones mayores de templado [productos no específicos] Calidad del templado: Interferencia en la reacción de restos de fenol, EDTA, proteinasa K. - Se recomienda purificación exhaustiva: precipitación con etanol y lavado con etanol 70%,purificación por columna.

Componentes de la PCR • Primers Criterios para selección y diseño: – Tamaño usual de 15-30 nt – Contenido de GC: 40-60%. – Más de 3 G o C en el 3'- puede generar uniónno específica. – No debe de generar auto-complementación con otro primer para evitar primer-dimer y formación de loops (estructura de talloasa).

– No debe de haber una diferencia de Tm mayor a 5° Centre los dos primers.

Componentes de la PCR
• Primers – Estimación de la Tm y temperatura de alineamiento: Primer de menos de 25 bases:

Tm= 4 (G + C) + 2 (A + T)
donde G, C, A, T = número decada base. Temperatura de alineamiento: aprox. 5º C menos que la Tm – Para Pfu (y polimerasas con actividad exonucleasa 3’ 5’), puede haber degradación de los primers.

Componentes del PCR
•Concentración de MgCl2 - Una baja [Mg2+] resulta en una bajo rendimiento de PCR - Una alta [Mg2+] resulta en un incremento de productos inespecíficos - Se recomienda una baja [Mg2+] cuando la fidelidad...