Reacción En Cadena De La Polimerasa

Colegio Mayor Nuestra Señora del Rosario
Genética- Taller de PCR


1. Bovine serum albumin further enhances the effects of organic solvents on increased yield of polymerase chain reaction of GC-rich templates.
Eric M Farell, Gladys Alexandre. Department of Biochemistry, Cellular and Molecular Biology, University of Tennessee, Knoxville, TN 37996, USA
Reactivos:
* DMSO: impiden laformación de dímeros de primers y de bucles tanto en el ADN muestra como de los primers
* Formamida: Es utilizada cuando el ADN molde tiene numerosas secuencias ricas en C+G y se forman potentes estructuras secundarias, la formamida disminuye la formación de puentes de hidrógeno.
* BSA: Albumina sérica de bovino, esta promueve y expande los beneficios de la formamida y el DMSO cuando seagregan en conjunto con la BSA.
* Glicerol: Ayuda a estabilizar a Taq polimerasa
* Agua destilada: se utiliza para eliminar posibles inhibidores de la PCR

2. A) para la escogencia de los primers se debe tener en cuenta:
* Complementariedad de los primers con la cadena molde
* Longitud de los primers debe ser entre 18-24 pb ya que  ésta influye en la especificidad, latemperatura de fusión (Tm) y en el tiempo necesario para la unión del primer a la secuencia complementaria. La longitud del primer está directamente relacionada con la eficiencia de la unión primer-cadena molde, por tanto determina de igual forma los resultados de la PCR.
* Temperatura de fusión ésta debe ser similar en ambos primers ya que al tener diferentes Tm los cambios de temperaturaefectuados durante la amplificación podrían afectar la efectividad y especificidad de éstos. Esta debe ser entre 55ºC y 72ºC más o menos.
* Especificidad
* Contenido de G y C deberá ser entre 45-55% ya que si posee un gran porcentaje de G+C habrá una gran cantidad de triples enlaces por lo que había que someter al ADN a una mayor temperatura para lograr su desnaturalización.
* Secuencia3´ y 5´
B) La longitud es adecuada, ya que encuentra dentro del rango de 18 y 24pb. Cuando el primer es muy corto este podría unirse a diferentes secciones en un molde largo de ADN llevando a copias inespecíficas, por otro lado si tuviera más de 24pb podría retrasar el rendimiento del procedimiento.
C) Tm= 2(A+T)+ 4(G+C)
5´CGTTCAATTCGGCGCCCTATG3´ Tm= 2(3+6)+ 4(5+7) Tm=66ºC5´TCATCACAAATAGATGTTTCACAG3´ Tm= 2(9+7)+ 4(3+5) Tm= 64ºC
D) Como ya se mencionó anteriormente la Tm está directamente relacionada con la cantidad de G y C, entre mas G y C hayan mayor será la Tm. En cuanto a las zonas Poli C o Poli G estas podrían llevar a una hibridación inespecífica, con respecto a las zonas ricas en poli A y poli T estas pueden producir deshibridación del complejo molde– primer.

3. A)Contaminación de la PCR
Al ser un procedimiento tan sensible, esta puede amplificar ADN de otros organismos (bacterias, virus, etc.), lo más común es la contaminación con residuos de otras PCR hechas anteriormente con los materiales a utilizar. Se puede prevenir esta situación trabajando en un lugar apropiado (limpio, implementos estériles, entre otros).
B) Bandas de peso diferentes al esperadoSe puede deber a errores cometidos durante el proceso, esto puede ser principalmente por irregularidades con los primers. Puede ser debido a su composición (que formen bucles) o por su especificidad. Esto se puede prevenir verificando que los primers sean los adecuados para el procedimiento a agregando DMSO
C) No hay Formación de producto amplificado
Esto puede suceder debido a diferentesequivocaciones durante el proceso, como lo son el manejo de la temperatura, de las concentraciones, del tiempo, etc. Esto también puede ocurrir por la adición de sustancias inhibidoras de la PCR como por ejemplo quelantes del Mg+, grupo Hem, heparina, cristales de orina, etanol, entre otros.
Lo que se debe hacer es repetir el proceso cambiando los materiales utilizados (primers, recipientes,...