Splicing Alternativo

CUESTIONES A RESPONDER EN LA ELABORACIÓN DEL TRABAJO


1.- Antecedentes sobre el splicing alternativo en el momento de la publicación.
Anteriormente a la publicación del artículo se han llevado a cabo varios estudios sobre el splicing (procesamiento) alternativo en otros organismos. Por ejemplo, los antígenos T grande y t pequeña del virus SV40 se generan por conexión de un extremo 5’variable con otro 3’ constante (ocurre lo contrario que en lola), después se elimina un codón de terminación presente en el mRNA del antígeno t, siendo más pequeño. El procesamiento alternativo de los pre-mensajeros también se ha visto en el producto de la región E1A de los Adenovirus (parecido a lo que ocurre en SV40).
Otro ejemplo estudiado es en el gen T de troponina de ratón, donde los exones 2 y3 son mutuamente excluyentes: el 2 se usa en el músculo liso y el 3 en otros tejidos. Aquí hay una diferencia importante con el gen lola de Drosophila melanogaster, ya que en el gen T de ratón hay una diferenciación tisular en cuanto a la elección de un exón variable, mientras que en lola, la misma célula del tejido nervioso (durante desarrollo embrionario) genera distintos mensajeros en funcióndel exón variable utilizado.
En la propia D. melanogaster la determinación del sexo depende de una serie de interacciones en varios genes donde se producen casos de corte y empalme alternativos (comienza con la expresión de sxl, luego de tra y finalmente del gen dsx).
En humanos también se ha estudiado el procesamiento alternativo, es el caso del gen CD44, implicado en la aparición de cáncer demama. Este gen contiene exones constantes y variables alternativos. Las distintas isoformas de proteínas que se generan dependerán del corte y empalme alternativos en dos regiones diferentes que contienen exones del gen. En este caso, hay 10 exones constantes en los extremos 5’ y 3’ y 10 exones variables situados entre los exones constantes.

2.- Objetivo del trabajo.
En esta publicación se hancumplido una serie de objetivos:
Estudio y entendimiento de la generación de los mRNAs del gen lola por un procesamiento alternativo de exones procedentes de diferentes moléculas de pre-mRNA (codificadas por ambos alelos), generándose distintas isoformas de una misma proteína.
Relación del procesamiento alternativo de lola con el de otros genes de Drosophila (mod) y también de mamíferos.Estudio de las condiciones y requisitos necesarios para el trans-splicing alternativo de lola, y cómo afectan a la frecuencia con la que se produce este procesamiento alternativo.
Demostración de que al menos uno de los exones variables puede transcribirse a partir de su propio promotor, para luego unirse al exón constante (transcrito independientemente).

3.- ¿A qué pueden deberse los resultadosobtenidos?
Un primer resultado obtenido fue la viabilidad de moscas heterocigotas que habían sufrido mutaciones en distintos exones variables, frente a otras moscas heterocigotas que las sufrieron en el mismo exón (variable y constante). La posible explicación podría ser la complementación interalélica entre los alelos mutados en diferentes exones variables.
Pero además, se vio que combinandomutaciones en regiones constantes y variables también se obtenían moscas viables. Esto llevó a plantear tres modelos que lo explicaran: el gen silvestre fue generado por recombinación o conversión; complementación funcional entre dos proteínas mutadas; procesamiento interalélico generando un mRNA funcional. Ésta última fue la que explicó mejor los resultados, la complementación interalélica entre unaregión constante mutada con otra región variable mutada (de tal manera que se unen el exón constate no mutado de un alelo con el exón variable no mutado del otro alelo) permitió la formación de mRNA quiméricos.
Otro resultado obtenido fue la frecuencia con que se produce el procesamiento interalélico. Se realizó una electroforesis de RNA en la que aparecían distintas bandas tras un análisis de...