Técnicas De Marcaje Celular

TEMA 10
Técnicas de marcaje celular. Isótopos radiactivos. Técnica
autorradiográfica. Detección de proliferación celular y trazado de vías
metabólicas. Uso de bromodesoxiuridina para estudios de proliferación
celular. Detección de muerte celular. Criterios morfológicos y afinidad por
los colorantes. Técnica del TUNEL. Hibridación in situ de ácidos nucleicos.

Guión:
-Histoautorradiografía.
Isótopos radiactivos.
Interés biológico de los isótopos radiactivos.
Técnicas autorradiográficas.
Aplicaciones biológicas de estas técnicas
1. Estudio de la dinámica y trazado de procesos metabólicos.
2. Estudio de proliferación y seguimiento celular.
- Bromodesoxiuridina en estudios de proliferación celular.
- Detección de muerte celular
Apoptosis y necrosis.
Detección de apoptosisa) Técnica del TUNEL
b) Detección de "Caspasas" por métodos inmunocitoquímicos.
Detección de muerte celular por criterios morfológicos y tintoriales.
- Técnicas de hibridación in situ.

HISTOAUTORRADIOGRAFÍA

-Consiste en la detección y localización de sustancias radiactivas en células y tejidos
Isótopos radiactivos

Isótopos radiactivos
-Un elemento químico es un conjunto de átomos conidéntico número de protones.
-Por norma general el número de neutrones es igual al de protones.
-En un elemento químico pueden existir algunos átomos con diferente número de neutrones.
-Estos átomos son ISÓTOPOS de ese elemento.
*Todos los isótopos de un mismo elemento tienen idénticas características químicas.
*Sin embargo, sus propiedades físicas varían en función de su distinta masa.
-Lamayor parte de isótopos son inestables por el desequilibrio protones-neutrones.
-Siendo inestables, tienden a pasar a un estado estable:
Se desintegran emitiendo partículas cargadas (radiaciones).
“isótopos radiactivos”
-Escasos en la naturaleza, pero fácilmente obtenibles con un reactor nuclear.
*Interés biológico de los isótopos radiactivos:
-Podemos marcar diferentes sustancias deinterés biológico con isótopos radiactivos.
-Después podremos rastrearlasen el tejido (o incluso dentro de las células).
-Ejemplo:

a) mantener algas unicelulares en una atmósfera de 14CO 2.
b) a distintos tiempos tomamos muestras y las homogeneizamos.
c) separamos los diferentes componentes por cromatografía.
d) identificamos bioquímicamente todos los compuestos con 14C.

Podemos identificarlos componentes de la ruta fotosintética del alga desde CO 2 a azucares
con gran sensibilidad
-Se pueden seguir rutas metabólicas completas
con gran precisión
-Para rastrear esas sustancias utilizaremos TÉCNICAS AUTORRADIOGRÁFICAS.

Grupos B y D
Curso 2004-2005
Prof. Carlos Crespo Rupérez

Técnicas autorradiográficas
-La radiactividad impresiona a las emulsiones fotográficas

*Elprincipio es similar a la impresión luminosa de la fotografía.
-Puedo inyectar a un animal con un isótopo radiactivo (ej. 125 I).
-Al cabo de un tiempo lo proceso histológicamente: -perfusión
-disección (ej. tiroides).
-inclusión/corte.
-recogida de cortes

-Tendré las secciones (de tiroides) marcadas con el isótopo radiactivo:
a) Pongo en contacto las secciones con una emulsión fotográfica.-La emulsión puede ser una solución líquida
de gelatina y bromuro de plata.
-En ella bañamos
secciones.

los

portas

con

las

-Se deja que se seque la fina película de
emulsión sobre las secciones.
b) Las secciones se dejan en contacto con la emulsión un tiempo de exposición
determinado.
c) Durante el tiempo de exposición, las
emisiones de radiactividad de los
isótoposactuarán sobre los cristales
de bromuro de plata de la emulsión
reduciéndolos.
d) Mediante un proceso de “revelado”
similar al fotográfico, se acelera la
reducción de los cristales de bromuro
de plata a plata metálica.
e) Por último se “fija” la emulsión con
tiosulfato como en fotografía.

-El resultado será granos de plata metálica fácilmente visibles a microscopio justo encima
del...