teñido Grim

La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial empleado en Bacteriología para la visualización debacterias, sobre todo en muestras clínicas. Debe su nombre al bacteriólogo danés Christian Gram, que desarrolló la técnica en1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una primera aproximación a la diferenciaciónbacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.
Metodología
Recoger muestras.
Hacer el extendido en espiral.
Dejar secar a temperatura ambiente o fijarlas utilizando un mechero.
Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3 vecesaprox.)
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1 minuto. Todas las células gram positivas y gram negativas se tiñen de color azul-púrpura.
Enjuagar con agua.
Agregar lugol y esperar entre 1 minuto.
Enjuagar con agua.
Agregar acetona y/o alcohol y esperar de 8 a 15 segundos aproximadamente (parte crítica de la coloración).
Enjuagar con agua.
Tinción de contrasteagregando safranina o fucsina básica y esperar 45 segundos. Este tinte dejará de color rosado-rojizo las bacterias Gram negativas.
Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersión.
[editar]Explicación
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas) a través de la pared bacteriana.El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales están presente para solubilizar el yodo, y actúan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa con el cristal violeta.
La mezcla dealcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos sí lo hacen.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una coloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de lacoloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al término del protocolo, las Gram positivas se verán azul-violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hizo latinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).
Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una soluciónde yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que éste no arrastre más colorante. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde de malaquita.
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aún después de tratarlos con undecolorante, y el color no se modifica al añadir éste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloración y retienen la segunda, de gramnegativos. Basándonos pues, en la reacción Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los...