tecnicas bioquimicas

Técnicas bioquímicas
para el estudio de la
célula

Niveles a los que se estudia la célula
Nivel celular

Nivel subcelular
A nivel organelo
-Núcleo
-Mitocondria
-RER, membrana celular
-REL
-Citosol

A nivel molecular: Macromoléculas
Proteins

Carbohydrates

Estrategia general
_Fraccionamiento celular
_Purificación/Identificación
_Estudio de la estructura/función

A nivelatómico
C, H, O, N, S, P

Lipids

Nucleic acids

Citometría de flujo

Citómetro*de Flujo clasificador (“sorter”)

*Puede seleccionar 1/1000
células y clasificar miles/s

Fraccionamiento celular
Conjunto de métodos y técnicas que tienen como objetivo
obtener fracciones puras o enriquecidas de un determinado
componente celular, ya sea éste un organelo (mitocondrias,
núcleos,peroxisomas, etc.), una fracción de membrana
(membrana total, plasmática, mitocondrial) o un complejo
multiproteico (citoesqueleto de actina, microtúbulos, poros
nucleares, etc.), para poder estudiar su bioquímica y/o
fisiología fuera del ambiente complejo de la célula intacta.
Consta de dos fases:
_Obtención de un homogenado o extracto
(homogeneización o ruptura de tejidos y células)_Separación de la fracción deseada
(diferentes tipos de centrifugación)

Fraccionamiento celular

Homogeneización

Células

Homogenado

Centrifugación

Métodos de homogeneización
TEJIDO:

Animal 
Vegetal 

CULTIVO:

Tejido animal

homogeneizador (politrón)
N2 líquido + mortero
arena + mortero

Bacterias 
Levaduras 
Células mamífero 

detergente o ultrasonido(sonicación)
bolas de vidrio + vórtex (agitación fuerte)
detergente + rascar (scraper)

Tejido vegetal

Bacterias

Levaduras

Células mamífero

MétodosMétodos de homogeneización…..
de homogeneización………

Métodos de homogeneización…..
Centrifugación
Diferencial
Zonal
Isopícnica
DIFERENCIAL:
el homogenado
es centrifugado
repetidas
veces a altas
velocidades,
sedimentándoloprogresivamente
en pequeñas
partículas

Fracción
nuclear

Fracción
mitocondrial

Citosol
Fracción
microsomal

ZONAL: el
homogenado se
aplica sobre un
gradiente de
densidad
(sacarosa, cloruro
de cesio) y al
centrifugar cada
componente se
desplaza hasta la
zona de densidad
igual a la suya.

Fraccionamiento celular, utilizando centrifugación diferencial,
para aislarorganelos desde el tejido hepático.

Centrifugación zonal en sacarosa

Separación de células u organelos

Purificación de organelos por centrifugación en
Purificación de orgánulos por centrifugación en gradiente de densidad
gradiente de densidad (zonal)

Centrifugación isopícnica (CsCl)

Separación de macromoléculas
(proteínas, ácidos nucléicos)

Algunas de las técnicas utilizadasdurante el fraccionamiento celular
Tejido (diferentes tipos celulares)

Células en cultivo
Células animales o vegetales

Obtención de
homogenados o extractos
Mortero, licuadora,
homogeneizador potter
Filtración
Organelos libres

Obtención de células en suspensión
Rompimiento de matriz celular con
colagenasa, tripsina, EDTA o celulasa y
pectinasa

Bacterias
Utilización delisozima o sonicación

Aislamiento de un tipo celular Adhesión diferencial, filtración en
mallas, unión de proteínas superficiales a anticuerpos unidos en
columnas, centrifugación diferencial e isopícnica o separador de
células activado por fluorescencia (Sorter)
Centrifugación
Membranas y
organelos libres

Centrifugación
diferencial o en
gradiente (zonal)

Protoplasto: Ruptura demembrana plasmática
con shock osmótico, sonicación o filtración con
presión (french press)

Núcleo>mitocondria>m. plasmática>Subunidades >citosol
cloroplasto f. microsomal ribosomales
lisosomas
peroxisomas
Organelo específico
Sonicación

Protoplasto bacteriano
Sonicación
Centrifugación

Membranas
Utilización de detergentes o sonicación

Matriz de organelo o citosol de bacterias...