Tecnicas microscopicas

ILUMINACION DE KÔHLER
La iluminación Köhler se compone de dos diafragmas, un diafragma de campo situado a nivel de la lámpara y un diafragma de apertura, situado debajo del condensador.
FUNDAMENTO
La imagen del diafragma de campo es proyectada en el plano de la preparación por el condensador, el cual se desplazará verticalmente hasta conseguir una imagen lo más nítida posible del diafragma (Lailuminación más nítida se consigue cuándo el condensador se encuentra lo más cerca de la preparación). El diafragma de campo sirve para regular la apertura de la iluminación, cerrando éste diafragma se incrementan los contrastes y la profundidad de campo y disminuye el poder de resolución. Es imprescindible asegurar que el filamento de la lámpara esté bien centrado con relación al condensador dela lámpara, que el haz esté bien dirigido por el espejo hacia la cara de entrada del condensador.
ANTECEDENTES
En el año 1893, el profesor August Köhler propuso un método de iluminación para optimizar la observación microscópica y la microfotografía (15), que permite aprovechar al máximo las capacidades de las lentes (objetivos) iluminando la muestra en estudio con un campo de luz uniforme cuyodiámetro sea igual al del área de captura del objetivo. Los microscopios modernos están diseñados para aplicar la iluminación Köhler y los requerimientos son (figs. 4-12 y 4-13):
• Condensador que sube y baja para enfocar el cono de luz.
• Bombilla con lente colectora.
• Dos diafragmas, un diafragma de campo situado a nivel de la lámpara y un diafragma de apertura, colocado debajo delcondensador.
El condensador se desplaza verticalmente hasta obtener una imagen nítida del diafragma de campo. La iluminación ideal se consigue cuándo el condensador se encuentra lo más cerca de la preparación. El diafragma de campo regula el diámetro de la apertura de la iluminación y al cerrarlo se incrementan los contrastes (15). Una vez ajustada la iluminación Köhler no se debe regular la intensidad dela luz o el brillo bajando el condensador o cerrando la apertura de diafragma-iris, por el contrario, se regula la intensidad de la lámpara mediante un ajuste de voltaje.
La función de la iluminación Köhler es iluminar un especimen con un campo uniforme de luz que sea del mismo diámetro que el área de captura del objetivo. Una imagen del campo diafragma se enfoca por la lente condensadora sobreel plano del especimen, iluminando de esta manera con un cono sólido de luz homogénea. El ajuste del campo iris limita el diámetro del cono de luz de manera que sólo el campo de visión (y no más) de cualquier lente objetivo dada sea iluminada. Iluminando sólo el cammpo de visión disminuye la degradación de luz por dispersión.
La iluminación Köhler es un prerequisito para todos los otros métodosde visualización.
CONTRASTE DE FASES
Las investigaciones iniciales de Frits Zernike al inicio de la década de 1930 revelaron que en microscopía, al crear interferencias en la luz empleada para iluminar el espécimen se creaban condiciones que producían un incremento del contraste. Este descubrimiento le valió el premio Nobel en física en el año 1953 y revolucionó la investigación en biomedicinaal permitir el estudio de células vivas. Con esta técnica de iluminación se aumenta el contraste de manera notoria entre las partes claras y oscuras de las células transparentes.
El principio es semejante al de campo oscuro; se ilumina la muestra con un cono hueco de luz pero mucho más estrecho. Se emplea un filtro en forma de anillo que disminuye la intensidad de la luz y al mismo tiempo provocaun retraso o desfase en la longitud de onda de la luz. Este método induce variaciones sutiles en el índice de refracción (determinado por el espesor) de los especímenes translúcidos permitiendo visualizar una riqueza de detalles muy finos en la estructura, los cuales pasarían desapercibidos con una iluminación de campo claro (15).
Los heterogéneos componentes celulares absorben la luz de...