Tesis

Índice

ÍNDICE

-1-

Raúl V. Durán Díaz

-2-

Índice

ÍNDICE
ÍNDICE DE FIGURAS
ÍNDICE DE TABLAS
ABREVIATURAS

1
7
11
13

1. INTRODUCCIÓN

17

1.1. Objetivos de la tesis
1.2. Las cianobacterias
1.3. La cadena fotosintética y respiratoria en cianobacterias
1.3.1. La cadena fotosintética
1.3.2. La cadena respiratoria
1.3.3. Fotosistemas
1.3.3.1. Fotosistema II1.3.3.2. Fotosistema I
1.3.4. Complejo de citocromos b6f
1.3.5. Citocromo c oxidasa
1.3.6. Plastocianina y citocromo c6
1.3.6.1. Plastocianina
1.3.6.2. Citocromo c6
1.3.6.3. Comparación estructural entre plastocianina y citocromo c6
1.4. Mecanismos de reacción
1.4.1. Reducción del fotosistema I
1.4.2. Reducción de la citocromo c oxidasa

19
19
21
21
24
25
25
28
31
33
36
36
3942
43
43
48

2. MATERIALES Y METODOS

51

2.1. Organismos y Condiciones de Cultivo
2.1.1. Cianobacterias
2.1.2. Escherichia coli
2.1.3. Métodos de recogida de células
2.2. Manipulación y análisis de DNA
2.2.1. Plásmidos y oligonucleótidos utilizados
2.2.2. Aislamiento de DNA
2.2.2.1. Aislamiento de DNA plasmídico de Escherichia coli
2.2.2.2. Aislamiento de DNA total deSynechocystis
2.2.3. Introducción de DNA en organismos por transformación
2.2.3.1. Transformación de células de Escherichia coli

53
53
55
56
56
56
58
58
59
59
59

-3-

Raúl V. Durán Díaz

2.2.3.2. Transformación de células de Synechocystis
2.2.4. Análisis y cuantificación de DNA
2.2.4.1. Electroforesis de DNA en geles de agarosa
2.2.4.2. Cuantificación de DNA
2.2.5. Extracción de DNAde geles de electroforesis
2.2.6. Manipulación enzimática de DNA
2.2.7. Reacción en cadena de la polimerasa (PCR)
2.2.8. Secuenciación de DNA
2.2.9. Detección de secuencias de DNA mediante hibridación con sonda
radiactiva
2.3. Manipulación y análisis de RNA
2.3.1. Tratamiento del material
2.3.2. Aislamiento de RNA total de Synechocystis
2.3.3. Electroforesis de RNA
2.3.4. Análisis deRNA mediante Northern blot
2.4. Fraccionamiento celular de Synechocystis
2.5. Métodos de purificación y detección de proteínas
2.5.1. Purificación de proteínas
2.5.2. Electroforesis en gel de SDS-poliacrilamida
2.5.3. Transferencia de proteínas a filtros de difluoruro de polivinilideno
2.5.4. Hibridación de proteínas con anticuerpos policlonales
2.5.5. Electroforesis de proteínas en gelbidimensional
2.5.5.1. Tratamiento de las muestras
2.5.5.2. Isoelectroenfoque
2.5.5.3. Separación por tamaño
2.5.6. Identificación de proteínas mediante huella dactilar peptídica
2.6. Espectrofotometría cinética inducida por láser
2.6.1. Descripción del sistema
2.6.2. Preparación de las muestras y mezcla de reacción
2.6.3. Análisis de los datos
2.7. Espectrofotometría cinética de flujodetenido
2.7.1. Descripción del sistema
2.7.2. Mezcla de reacción
2.7.3. Análisis de los datos
2.8. Determinación del desprendimiento de oxígeno en células completas
2.9. Otros métodos
2.9.1. Cuantificaciones espectrofotométricas
2.9.2. Cuantificación de proteína total

-4-

59
61
61
61
62
62
63
63
63
64
64
64
65
65
66
66
66
67
68
68
69
69
69
69
70
70
71
72
72
7373
74
74
75
75
75
76

Índice

2.9.3. Análisis informático de secuencias de DNA y visualización de proteínas
3. RESULTADOS

76
77

3.1. Análisis comparado de la reducción in vivo del fotosistema I en estirpes
silvestres de cianobacterias
3.1.1. Comparación de estirpes mesófilas y termófilas
3.2. Clonación de los genes petE y petJ de Synechocystis y sus secuencias
flanqueantes3.3. Deleción de los genes petE y petJ en Synechocystis
3.4. Análisis de las estirpes ∆petE y ∆petJ de Synechocystis
3.4.1. Expresión de plastocianina y citocromo c6 en las estirpes ∆petE y ∆petJ
3.4.2. Crecimiento fotoautotrófico de las estirpes ∆petE y ∆petJ
3.4.3. Reducción in vivo del fotosistema I en las estirpes ∆petE y ∆petJ
3.4.4. Crecimiento heterotrófico de las estirpes ∆petE y...