Tinción Gram, Tinción Ziehl Neelsen

TINCIÓN GRAM
La tinción Gram, suele ser un estudio fundamental por cumplir funciones.
-La identificación preliminar de la bacteria causal de la infección.
-Y la utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano.
Los reactivos empleados en la tinción de Gram son el cristal violeta (colorante básico), lugol (Mordiente), alcohol cetona (decolorante) y safranina (colorante decontraste).
Fundamentos de diferenciación de Gram positivo y Gram negativo.
Los fundamentos de la técnica se basan en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias, Gram positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de peptidoglucano, la cual impide que escape el complejo cristal violeta-lugol.
Por el contrario, la capa de peptidoglucanode las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmática externa lipídica, de composición distinta a la interna, susceptible a la decoloración con el alcohol- acetona, el cual, actúa como un solvente.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tiñen distinto, debido a estas diferencias constitutivas de su pared.
La clave es el peptidoglicano, ya que es elmaterial que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporción que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloración, se debe a que la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgánicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona.
La capa de peptidoglicano que posee es demasiadodelgada como para poder retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azul-violácea.
Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular más resistente y con mayor proporción de peptidoglicanos, no son susceptibles a la acción del solvente orgánico, si no que este actúa deshidratando losporos cerrándolos, lo que impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloración azul-violácea.
Técnica de la función.
-Fijar un frotis.
*Con la ayuda de un mechero flamear un asa bacteriológica y esperar que enfríe un poco.
*Tomar el asa (previamente flameada) y con está tomar un poco de muestra.
*Una vez obtenida un pequeña cantidad de la muestra (con el asa),hacer que ésta tenga contacto con una lámina portaobjetos, la cual servirá para depositar la muestra contenida en el asa.
*Con el asa (contenido de la muestra) sobre la lámina portaobjetos, proceder a realizar la extensión de la muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lámina, de tal forma que al terminar la extensión, tengamos como productouna espiral en la parte media de la lámina.
*Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo, sólo se pasa por la llama, puesto que el calo excesivo puede cambiar la morfología celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquél en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente paraser colocado sobre el dorso de la mano.
-Tinción
Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta china utilizar sólo una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tinción de un minuto está dada para trabajar a una temperatura de 25° C.
-Enjuague
Al transcurrir elminuto, se debe enjuagar la lámina conteniendo la muestra con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la lámina que no contiene muestra. El chorro debe ser delgado, aproximadamente de medio a un milímetro de espesor. También el enjuague se debe realizar poniendo la lámina portaobjetos en posición inclinada hacia...